国家自然科学基金申请书 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组(对照组Ⅰ) ④无出血症而血小板聚集正常组(对照组Ⅱ) 这4组病例均参与实验研究和对比观察,争取积累足够病例及实验室资料。 (2)实验室检查:按血小板聚集途径分为3部分 ①血小板活化检测:采用免疫荧光单克隆抗体(CD63一异硫氰酸(FIT0,TSD一藻红蛋 白及CD62P-FITC)标记采凝血酶刺激后的血小板,应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ②GPI-X-V受体检测: A:采用CD42a-b-c(抗GPIb/GPⅨ/GPV)及CD49b或SZ-2单克隆抗体标记抗 凝全血,流式细胞仪下测定血小板GPIbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及印痕转移( Western blot)法测定 血小板表面 GP I ba、GPⅨ、GPV及PARl、PAR4的蛋白表达及其之间的比例。并测 定PAR1与PAR4活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋 白、肌动连接蛋白以及 GPIb a的水平,实验过程按本室报道的方法进行。 C:在PARs肽刺激血小板活化同时,应用 Cytochalasin D肌动蛋白多聚化抑制剂) BAPTA/AM(螯合胞内Ca2)、 Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶P13K及肌球蛋白轻 链激酶MLCK)、 Apyrase(低 ATP/ADP酶,促使ADP分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C选择性抑制剂)及Y27632(抑制Rho激酶)等多种血小板抑制剂,比较它们对患者及 正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响,有利 于研究PARS受体活化与出血性血小板病发病的部分关系,并探讨其他可能存在的信 号传导途径。 D:采用 RT-PCR技术测定PARI、PAR4及 GP I b/GPⅨGPV、 GPI b a mRNA 的表达及转录水平。 E:根据 Genebank数据库已有的PARI、PAR4及 GPI b/GPⅨXGPV、 GPI ba cDNA或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析,确定上述凝血酶受体的结合部位及其 与配体结合区域的关键蛋白质,重点检测其氨基酸编码碱基有无突变 (2)益气活血方治疗:将拟定的益气活血方药物水煎醇沉,粗提物制成片剂(前期已 经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证,作为院内制剂应用达8年)。 6个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况,同时 版本1003.094国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.003.094 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组（对照组Ⅰ） ④无出血症而血小板聚集正常组（对照组Ⅱ） 这 4 组病例均参与实验研究和对比观察，争取积累足够病例及实验室资料。 （2）实验室检查：按血小板聚集途径分为 3 部分。 ①血小板活化检测：采用免疫荧光单克隆抗体（CD63－异硫氰酸（FITO，TSD－藻红蛋 白及 CD62P－FITC）标记采凝血酶刺激后的血小板，应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ② GPⅠ-Ⅸ-Ⅴ受体检测： A：采用 CD42a-b-c（抗 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ）及 CD49b 或 SZ-2 单克隆抗体标记抗 凝全血，流式细胞仪下测定血小板 GPⅠbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及印痕转移（ Western blot）法测定 血小板表面 GPⅠba、GPⅨ、GPⅤ及 PAR1、PAR4 的蛋白表达及其之间的比例。并测 定 PAR1 与 PAR4 活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋 白、肌动连接蛋白以及 GPIbα的水平，实验过程按本室报道的方法进行。 C：在 PARs 肽刺激血小板活化同时，应用 Cytochalasin D(肌动蛋白多聚化抑制剂)、 BAPTA/AM(螯合胞内 Ca2＋ )、Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶 P13-K 及肌球蛋白轻 链激酶 MLCK)、ApyraseVII(低 ATP/ADP 酶，促使 ADP 分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C 选择性抑制剂)及 Y27632(抑制 Rho 激酶)等多种血小板抑制剂， 比较它们对患者及 正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响， 有利 于研究 PARs 受体活化与出血性血小板病发病的部分关系，并探讨其他可能存在的信 号传导途径。 D：采用 RT-PCR 技术测定 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα mRNA 的表达及转录水平。 E：根据 Genebank 数据库已有的 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα cDNA 或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析，确定上述凝血酶受体的结合部位及其 与配体结合区域的关键蛋白质，重点检测其氨基酸编码碱基有无突变。 （2） 益气活血方治疗：将拟定的益气活血方药物水煎醇沉，粗提物制成片剂（前期已 经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证，作为院内制剂应用达 8 年）。 6 个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况，同时