水产科学 第23卷 用25m1%醋酸乙腈溶液重复提取1次,离心, 1.2仪器和设备 合并上清液,在分液漏斗中加入25m乙腈饱和正 Water∞2695高效液相色谱仪,配有二极管阵列己烷,反复震荡脱脂净化,静置分层后将下层液移 检测器和助温箱;均质器( ULTRA TURRAX);氮至100m蒸发瓶中,于40℃旋转蒸发近干,用氮 气浓缩装置( PIERCE MODEL1878);快速混匀器气吹干。加入1.5m流动相,快速混匀后置于超 (美国 MODEL M37610-26);旋转蒸发仪;高速台声波池中超声1min,移至1m一次性注射器中 式离心机( EPPENDOF,5810R);电子分析天平通过0.45um膜过滤到液相进样瓶中,待测 ( SARTORIUS R0D,精确至0.0001g);精密pH1.6色谱条件及工作曲线 计;一次性注射器滤器;过滤膜(0.45μm,DU 色谱条件:色谱柱ODS-C18(46mm×250 RAPORE)等。 mm);柱温35℃;流速1.0n/min;进样量30叽 1.3化学试剂与溶液 检测波长278mm。流动相:0.01ml/L磷酸盐/三 乙腈(色谱纯);冰醋酸(分析纯);磷酸(分乙胺缓冲液·乙腈按(80+20)混合,使用前超声 析纯);正己烷(色谱纯,经乙腈饱和);三乙胺脱气10mn (分析纯);无水硫酸钠(500℃灼烧4h,置于干燥 工作曲线:取一系列标准混合溶液,在上述色 器中备用);恩诺沙星、环丙沙星标准品(SAM谱条件下检测药物含量,作出标准曲线。 公司,含量大于999%;恩诺沙星原粉(河南大 结果与分析 明实业有限公司生产,含量大于98%,批号 2.1线形范围 在0~10ugym范围内线性关系良好,恩诺沙 质量浓度为50g/m.的恩诺沙星和环丙沙星星和环丙沙星的标准曲线回归方程分别为r 混合标准溶液;1%醋酸乙腈溶液(1000n的容2.873×102+3.39×103X,y=-4.55×103+3.02 量瓶中加入10m的醋酸,乙腊定容至刻度);X0x(药物浓度,x平均峰面积);相关系数 0.01m/L磷酸盐/三乙胺缓冲液(在1000n的 容量瓶中加入0.68nL磷酸,重蒸水定容至刻度 2.2恩诺沙星和环丙沙星的分离与检测 三乙胺调节pH3.0)。 恩诺沙星和环丙沙星同是喹诺酮类药物,并且 1.4给药方式及取样 环丙沙星是恩诺沙星脱去乙基后的产物,所以二者 将实验用罗非鱼、中国对虾随机分组,罗非鱼在化学性质上有一定的相似,作者采用HHC法同 每组6尾,中国对虾每组12尾,每天按50ug/g 时分离并检测了样品中恩诺沙星和环丙沙星的含 的剂量投喂药饵(称取72g恩诺沙星原粉和199量,操作简单、分离度好、准确度高,最低检出限 g无药物残留饵料混合后制成药饵),连续投喂7可达0.01uyg。图1为鱼肌肉中恩诺沙星和环丙 d,同时设对照组。停药后0,12,24,48,96 沙星的色谱图 144,192,288,384,528h取样,罗非鱼取其背部 肌肉、肝脏和血液,对虾取肌肉。 1.5药物的提取方法 准确称取4.0g样品放入50mL塑料离心管中 加入25mI%醋酸乙腈溶液(血液样品,需要加 入10g无水硫酸钠),高速均质3min后放入超声 波池中超声2min,然后6000r/min离心10min,把 上清液转移到250的棕色分液漏斗中,将残渣 图1鱼肌肉样品中恩诺沙星和环丙沙星的色谱图 2 01994-2007 China Academie Journal Electronie Publishing House. All rights reserved hup: /ws cnki.net料) 。 112 仪器和设备 Waters2695 高效液相色谱仪 , 配有二极管阵列 检测器和助温箱 ; 均质器 (ULTRA TURRAX) ; 氮 气浓缩装置 (PIERCE MODEL 1878) ; 快速混匀器 (美国 MODEL M37610 - 26) ; 旋转蒸发仪 ; 高速台 式离心机 ( EPPENDOF , 5810R) ; 电子分析天平 (SARTORIUS R200D , 精确至 010001 g) ; 精密 pH 计 ; 一次性注射器滤器 ; 过滤膜 (0145μm , DU2 RAPORE) 等。 113 化学试剂与溶液 乙腈 (色谱纯) ; 冰醋酸 (分析纯) ; 磷酸 (分 析纯) ; 正己烷 (色谱纯 , 经乙腈饱和) ; 三乙胺 (分析纯) ; 无水硫酸钠 (500 ℃灼烧 4 h , 置于干燥 器中备用) ; 恩诺沙星、环丙沙星标准品 (SIGMA 公司 , 含量大于 9919 %) ; 恩诺沙星原粉 (河南大 明实 业 有 限 公 司 生 产 , 含 量 大 于 98 % , 批 号 20020804) 。 质量浓度为 50μg/ mL 的恩诺沙星和环丙沙星 混合标准溶液 ; 1 %醋酸乙腈溶液 (1000 mL 的容 量瓶中加入 10 mL 的醋酸 , 乙腈定容至刻度) ; 0101 mol/ L 磷酸盐/ 三乙胺缓冲液 (在 1000 mL 的 容量瓶中加入 0168 mL 磷酸 , 重蒸水定容至刻度 , 三乙胺调节 pH 310) 。 114 给药方式及取样 将实验用罗非鱼、中国对虾随机分组 , 罗非鱼 每组 6 尾 , 中国对虾每组 12 尾 , 每天按 50μg / g 的剂量投喂药饵 (称取 712 g 恩诺沙星原粉和 1993 g 无药物残留饵料混合后制成药饵) , 连续投喂 7 d , 同时设对照组。停药后 0 , 12 , 24 , 48 , 96 , 144 , 192 , 288 , 384 , 528 h 取样 , 罗非鱼取其背部 肌肉、肝脏和血液 , 对虾取肌肉。 115 药物的提取方法 准确称取 410 g 样品放入 50 mL 塑料离心管中 , 加入 25 mL 1 %醋酸乙腈溶液 (血液样品 , 需要加 入 10 g 无水硫酸钠) , 高速均质 3 min 后放入超声 波池中超声 2 min , 然后 6000 r/ min 离心 10 min , 把 上清液转移到 250 mL 的棕色分液漏斗中 , 将残渣 用 25 mL 1 %醋酸乙腈溶液重复提取 1 次 , 离心 , 合并上清液 , 在分液漏斗中加入 25 mL 乙腈饱和正 己烷 , 反复震荡脱脂净化 , 静置分层后将下层液移 至 100 mL 蒸发瓶中 , 于 40 ℃旋转蒸发近干 , 用氮 气吹干。加入 115 mL 流动相 , 快速混匀后置于超 声波池中超声 1 min , 移至 1 mL 一次性注射器中 , 通过 0145μm 膜过滤到液相进样瓶中 , 待测。 116 色谱条件及工作曲线 色谱条件 : 色谱柱 ODS - C18 ( 46 mm ×250 mm) ; 柱温 35 ℃; 流速 110 mL/ min ; 进样量 30μL ; 检测波长 278 nm。流动相 : 0101 mol/ L 磷酸盐/ 三 乙胺缓冲液 - 乙腈按 (80 + 20) 混合 , 使用前超声 脱气 10 min。 工作曲线 : 取一系列标准混合溶液 , 在上述色 谱条件下检测药物含量 , 作出标准曲线。 2 结果与分析 211 线形范围 在 0～10μg/ mL 范围内线性关系良好 , 恩诺沙 星和环丙沙星的标准曲线回归方程分别为 Y = - 21873 ×102 + 3139 ×105 X , Y = - 4155 ×103 + 3102 ×104 X ( Y 药物浓度 , X 平均峰面积) ; 相关系数 r > 019999。 212 恩诺沙星和环丙沙星的分离与检测 恩诺沙星和环丙沙星同是喹诺酮类药物 , 并且 环丙沙星是恩诺沙星脱去乙基后的产物 , 所以二者 在化学性质上有一定的相似 , 作者采用 HPLC 法同 时分离并检测了样品中恩诺沙星和环丙沙星的含 量 , 操作简单、分离度好、准确度高 , 最低检出限 可达 0101μg/ g。图 1 为鱼肌肉中恩诺沙星和环丙 沙星的色谱图。 图 1 鱼肌肉样品中恩诺沙星和环丙沙星的色谱图 6 水 产 科 学 第 23 卷 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net