中国药典三部附录(2005年版) 135种 页码数:2005版药典附录第44页 附录ⅥGA群脑膜炎球菌多糖 第一法测磷法(仲裁法) 本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值 以前的回收率。 试剂(1)流动相取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g,加水使溶解成1000m,混匀 用O.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.O (②)蓝色葡聚糖2000溶液取蓝色葡聚糖200020mg,加流动相使溶解成10ml (3)维生素B12溶液称取l0mg维生素B12,加流动相使溶解成10ml 色谱柱的制备取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200m,加流动相400m充分 搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次 后,加流动相200ml,混匀,抽去凝胶中的空气,装于1.5m×90cm色谱柱中,约 87cm高,,用流动相洗脱,流速为每小时15~20ml,以2~3倍柱床体积的流动相 洗脱(约500m1),使柱床平衡。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lm加于已平衡的色谱柱中,以流动相洗 脱,流速每小时15~20ml,用组分收集器收集洗脱液,每管收集3~5ml,照紫外 可见分光光度法(附录ⅡA),在波长260m处测定各管洗脱液的吸光度,以吸光 度为纵坐标,洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图,260nm波长处的峰顶洗脱液体 积为空流体积V0 取维生素B12溶液lml,自“加于已平衡的色谱柱中起,同法操作,370nm波长处 的峰顶洗脱液体积为柱床体积ⅵ 测定法取供试品约lml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加 于已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,用组分收集器收集洗脱液,每管收集5ml 照磷含量测定法(附录ⅦA测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷 含量为纵坐标,洗脱液体积(m1)为横坐标作图,主峰峰顶洗脱液体积为vs 按下式计算 KD=ve-vO/Vi-V0。 式中KD为供试品分配系数 ve为供试品洗脱液体积,ml; V0为空流体积 Ⅵ为柱床体积 计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率 Rx(%=Ax/At×100% 式中Rx为KD值<O.5供试品的多糖回收率 Ax为供试品在KD值<O.5各管洗脱液的磷含量之和; At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。 第二法仪器法 试剂与色谱柱的制备同第一法 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml与维生素B1溶液0.2m,混匀后加于 已平衡的色谱柱中,以流动相洗脱,流速每小时15~20m,检测波长206nm,用 组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,色谱图中,第一峰为蓝色葡聚糖2000峰中国药典三部附录（2005 年版） 135 种 页码数： 2005 版药典附录第 44 页 附录 VI G A 群脑膜炎球菌多糖 第一法测磷法(仲裁法) 本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定 KD 值 以前的回收率。 试剂 (1)流动相取氯化钠 11．7g、叠氮钠 0．1g，加水使溶解成 1000ml，混匀， 用 O．1mol／L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7．O。 (2)蓝色葡聚糖 2000 溶液 取蓝色葡聚糖 2000 20mg，加流动相使溶解成 10ml。 (3)维生素 B12 溶液称取 10mg 维生素 B12，加流动相使溶解成 10ml。 色谱柱的制备取琼脂糖 4B 凝胶或琼脂糖 CL-4B 凝胶约 200ml，加流动相 400ml 充分 搅拌，放置约 1 小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复 3～5 次 后，加流动相 200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于 1．5cm×90cm 色谱柱中，约 87cm 高，．用流动相洗脱，流速为每小时 15～20ml，以 2～3 倍柱床体积的流动相 洗脱(约 500m1)，使柱床平衡。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖 2000 溶液 lml 加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗 脱，流速每小时 15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集 3～5ml，照紫外 -可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长 260nm 处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光 度为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图，260nm 波长处的峰顶洗脱液体 积为空流体积 V0。 取维生素 B12 溶液 lml，自“加于已平衡的色谱柱中起，同法操作，370nm 波长处 的峰顶洗脱液体积为柱床体积 Vi。 测定法取供试品约 lml(含多糖抗原 3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，加 于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集 5ml， 照磷含量测定法(附录ⅦA)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷 含量为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为 Ve。 按下式计算 KD=ve-v0/Vi-V0。 式中 KD 为供试品分配系数； Ve 为供试品洗脱液体积，ml； V0 为空流体积，ml； Vi 为柱床体积，ml。 计算供试品在 KD 值<0．5 的多糖回收率 Rx(％)=Ax/At×100％ 式中 Rx 为 KD 值<O．5 供试品的多糖回收率； Ax 为供试品在 KD 值<O．5 各管洗脱液的磷含量 之和； At 为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。 第二法仪器法 试剂与色谱柱的制备同第一法。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖 2000 溶液 lml 与维生素 B12 溶液 0．2ml，混匀后加于 已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时 15～20ml，检测波长 206nm，用 组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为蓝色葡聚糖 2000 峰