峰顶的洗脱液体积为空流体积ⅴo:第二峰为维生素B12的峰,峰顶的洗脱液体积 为柱床体积Vi 测定法取供试品约lm(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解), 加于已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,流速为每小时15~20m,检测波长 206nm,用组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,即得。 按下式计算 KD=Ve- VO/Vi-VO 式中KD为供试品分配系数 V为供试品洗脱液体积,ml K为空流体积,m1 Ⅵ为柱床体积,ml 计算供试品在KD值<O.5多糖回收率 Rx(%)=Ax/At*100% 式中凡为KD值<O.5供试品的多糖回收率(%) Ax为供试品在KD值<O.5的色谱图面积; A0为供试品色谱图总面积 【附注】过柱操作在10~20℃进行。 书页号:2005版药典三部附录71页 附录ⅪKIgG含 量测定法 (紫外-可见分光 光度法) 本法系依据免疫球蛋白G(gG)与相应的抗体特异性结合后,在适宜的电解 质、温度、pH条件下,产生凝集反应,形成抗原抗体复合物,根据供试品的吸 光度求出供试品中1gG的含量。 试剂(1)缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷(Iris)l242g、氯化钠9g、聚乙二醇 (PEG600050g、牛血清白蛋白(BSA)lg、叠氮钠(NaN3)lg,加水溶解,用10mo/L盐酸调 pH至74,加水稀释至1000ml (2)抗人lgG血清按说明书要求将冻干抗人lgG血清复溶,按标示效价取 量抗人IgG血清,加缓冲液稀释至抗体最终效价为1:4(例如,抗人IgG血清效价为 l:100,取原液2ml加抗体缓冲液48m),充分混匀,0.45μm膜过滤。4℃保存备用 lgG标准品溶液的制备用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每lml含02~6·Omg范围内做 适当的系列稀释(通常做5个稀释度) 供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释 度,其lgG含量均应在标准曲线范围内 测定法取供试品溶液10μl,加已预热至37℃的抗体液1m,混匀,每个稀释 度 做2管,37℃水浴中保温1小时,充分混匀,照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA), 于波长340nm处分别测定吸光度 用lgG标准品溶液10μ替代供试品溶液,同法操作峰顶的洗脱液体积为空流体积 V0；第二峰为维生素 B12 的峰，峰顶的洗脱液体积 为柱床体积 Vi。 测定法取供试品约 lml(含多糖抗原 3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)， 加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时 15～20 ml，检测波长 206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。 按下式计算 KD=Ve-V0/Vi-V0 式中 KD 为供试品分配系数； V 为供试品洗脱液体积，ml, K 为空流体积，m1； Ⅵ为柱床体积，ml。 计算供试品在 KD 值<O．5 多糖回收率 Rx(％)=Ax/At*100％ 式中凡为 KD 值<O．5 供试品的多糖回收率(％)； Ax 为供试品在 KD 值<O．5 的色谱图面积； A0 为供试品色谱图总面积。 【附注】 过柱操作在 10～20℃进行。 书页号：2005 版药典三部附录 71 页 附录Ⅺ K IgG 含 量测定法 (紫外-可见分光 光度法) 本法系依据免疫球蛋白 G(IgG)与相应的抗体特异性结合后，在适宜的电解 质、温度、pH 条件下，产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，根据供试品的吸 光度求出供试品中 IgG 的含量。 试剂 (1) 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠 9g、聚乙二醇 (PEG 6000)50g、牛血清白蛋白(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用 1.0mol/L 盐酸调 pH 至 7.4，加水稀释至 1000ml。 (2) 抗人 IgG 血清 按说明书要求将冻干抗人 IgG 血清复溶，按标示效价取一 定 量抗人 IgG 血清，加缓冲液稀释至抗体最终效价为 1：4(例如，抗人 IgG 血清效价为 1：100，取原液 2ml 加抗体缓冲液 48ml)，充分混匀，0.45μm 膜过滤。4℃保存备用。 IgG 标准品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将 IgG 标准品在每 1ml 含 0.2～6.0mg 范围内做 适当的系列稀释(通常做 5 个稀释度)。 供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低 3 个稀释 度，其 IgG 含量均应在标准曲线范围内。 测定法 取供试品溶液 10μl，加已预热至 37℃的抗体液 1ml，混匀，每个稀释 度 做 2 管，37℃水浴中保温 1 小时，充分混匀，照紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A)， 于波长 340nm 处分别测定吸光度。 用 IgG 标准品溶液 10μl 替代供试品溶液，同法操作