分子克隆实验小鼠β-actin基因片段T-A克隆及其鉴定201612
分子克隆实验 小鼠β-actin基因片段 T-A克隆及其鉴定 201612
实验原理T-A克隆重组：是简单的PCR产物直接重组方法原理：TaDNA聚合酶（具有有末端连接酶活性）在扩增目的基因片段时，可不依赖其模板，可在PCR产物两端（3’）自动加上碱基（尤其优先加上A）。为此，在T4DNA连接酶催化下，实现质粒载体（载体酶切切口具有游离T）和PCR产物的直接连接，实现DNA片段重组该法已广泛应用，如商品化载体如pGEM-T
T-A克隆重组：是简单的PCR产物直接重组方法 原理：TaqDNA聚合酶（具有有末端连接酶活性） 在扩增目的基因片段时，可不依赖其模板，可在 PCR产物两端（3’）自动加上碱基（尤其优先加 上A）。为此，在T4 DNA连接酶催化下，实现质粒 载体（载体酶切切口具有游离T）和PCR产物的直接 连接，实现DNA片段重组 该法已广泛应用，如商品化载体如pGEM-T 实验原理
EoRVe明7TA Cloning大轩菌感受李乳熊PMID19-TVecbr连接液SolutionI中包含FcoRV限制性酶及T4连接酶
ECORV识别位点EcoRV5.GATATC.33.CTATAG..5RFOORISRR!KotA001BMSoc887Hidm+→SacraRHHicnPctMCSlaczt酶切之后末端再添DMID19-Tor加T，就成可T克隆Vector质粒
酶切之后末端再添 加T,就成可T克隆 质粒
-互补筛选（蓝白色菌落筛选）原理：●pMD19-T质粒载体中具有LacZ（N)短区段，编码β-半糖苷酶N端146个AA（也称α-多肽），其前面的Plac可以启动LacZ(N)的转录和表达，但通常受抑制，在IPTG作用下，该抑制可去除；●受体菌大肠杆菌具有LacZ(C)短区段，可编码β-半乳糖苷酶C端部分；A-互补：当pMD19-T质粒载体转入相应大肠杆菌受体细胞中，LacZ(N)与LacZ(C)所编码产物可组合为一个具有活性的β-半糖苷酶全酶蛋白，从而使底物X-gal分解生色出现蓝色菌落；而当MCS序列区域内的LacZ(N)序列中插入外源基因后，该基因便不能正常表达，因此也就不能与受体菌实现α一互补作用，所以菌落呈白色。IPTG：异丙基硫代β一半乳糖苷
α-互补筛选（蓝白色菌落筛选） 原理： ⚫pMD19-T质粒载体中具有LacZ(N)短区段，编码β-半糖苷 酶N端 146个AA（也称α-多肽），其前面的Plac可以启动 LacZ(N)的转录和表达，但通常受抑制，在IPTG作用下，该 抑制可去除； ⚫受体菌大肠杆菌具有LacZ(C)短区段，可编码β-半乳糖 苷酶C端部分； Α-互补：当pMD19-T质粒载体转入相应大肠杆菌受体细 胞中，LacZ(N)与LacZ(C)所编码产物可组合为一个具有活 性的β-半糖苷酶全酶蛋白，从而使底物X-gal分解生色， 出现蓝色菌落；而当MCS序列区域内的LacZ(N)序列中插入 外源基因后，该基因便不能正常表达，因此也就不能与受 体菌实现α-互补作用，所以菌落呈白色。 IPTG：异丙基硫代β－半乳糖苷
TATA BOXβ-半乳糖苷酶基因透性酶基因乙酰基转移酶基因RA0RNApol调节基因操纵基因后劲垂因9>5mRNA调节蛋白IPTGIPTG：异丙基硫代β一半乳糖苷
调节基因 启动基因 操纵基因 β-半乳糖苷酶基因 透性酶基因 乙酰基转移酶基因 R P O Z Y A TATA BOX mRNA 调节蛋白 RNA RNA pol -pol IPTG ⚫IPTG：异丙基硫代β－半乳糖苷
操纵子调节基因PlacDNA-PiNICMCSLacz(N):lacztPlacLacz基因列N端部分，编码β-半端的46个AA（α-多肽）糖苷酸Plac通活性醇蛋白常受到外源DNA-ori抑制，pMD 19-T分解-9分解为蓝色但可被VectorIPTGα-互补解除ampRLacz(c] :LacZ基因序列C端部分，编码B-半糖苷酶C端部分EcoliXgal：5溴4氯3吲哚β一半乳糖苷·IPTG：异丙基硫代β一半乳糖苷
⚫Xgal：5溴4氯3吲哚β－半乳糖苷 ⚫IPTG：异丙基硫代β－半乳糖苷 Ecoli pMD 19-T Vector Plac Plac通 常受到 抑制， 但可被 IPTG 解除 活性酶蛋白 分解X-gal分解为蓝色 α-互补 LacZ(N)： LacZ基因序列N端部分，编码β-半 糖苷酶N端的146个AA（α-多肽） LacZ(C)： LacZ基因序列C端部分，编码β-半糖 苷酶C端部分 外源DNA 操纵子 调节基因 N C
实验安排1、小鼠基因组DNA提取2、PCR扩增、纯化与鉴定目的基因3、PCR扩增片段的重组、转化小鼠重组DNA菌株筛选及培养（挑菌、增菌）45、小鼠重组质粒的提取、酶切及鉴定
实验安排 1、小鼠基因组DNA提取 2、PCR扩增、纯化与鉴定目的基因 3、PCR扩增片段的重组、转化 4、 小鼠重组DNA菌株筛选及培养(挑菌、增菌) 5、 小鼠重组质粒的提取、酶切及鉴定
1、小鼠基因组DNA提取作为PCR扩增目的基因的模版目的基因：β-actin基因
1、小鼠基因组DNA提取 作为PCR扩增目的基因的模版 目的基因：β-actin基因