四.基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 主要应用: 1.提高次级代谢产物的产量 2.改进代谢产物的组分 3.改进菌种的生理性能 4.产生新的代谢产物
四. 基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用 主要应用: 1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能 4. 产生新的代谢产物
(一)提高次级代谢产物的产量 基因工程技术提高抗生素产量的主要手段 1.增加限速酶的基因拷贝数 2.增加正调节基因,去除负调节基因 3.增加抗性基因的拷贝数
(一) 提高次级代谢产物的产量 基因工程技术提高抗生素产量的主要手段 1. 增加限速酶的基因拷贝数 2. 增加正调节基因,去除负调节基因 3. 增加抗性基因的拷贝数
1.增加限速酶的基因拷贝数 原理 Ec A B D E(代谢产物) 限速酶 Rate-limiting bottleneck Ea Eb Ec 例1:起始原料 ACV三肽 异青霉素N 青霉素 a-aminoadipic acid cysteine Ea:ACV合成酶 Ec:异青霉素N酰基水解酶 valine Eb:异青霉素N合成酶 青霉素酰基转移酶
1. 增加限速酶的基因拷贝数 原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代谢产物） 限速酶 Rate-limiting Bottleneck Ea Eb Ec 例1: 起始原料 ACV三肽 异青霉素N 青霉素 -aminoadipic acid L-cysteine Ea: ACV合成酶 Ec:异青霉素N酰基水解酶 L-valine Eb:异青霉素N合成酶 青霉素酰基转移酶
异青霉素N合成酶对 P chrysogenum青霉素产量的影响 菌株 原始菌株 低产菌株 高产菌株 Wis54-1255 AS-P-78 IPNs的基 9-14 因拷贝数 mRNA量 32-64 青霉素产量 100% 导入带INS 140% 的基因片段
异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响 菌株 原始菌株 低产菌株 高产菌株 Wis 54-1255 AS-P-78 IPNS 的基 1 ---- 9-14 因拷贝数 mRNA量 1 ---- 32-64 青霉素产量 100% 导入带IPNS 140% 的基因片段
增加IPNS基因提高青霉素产量 转化青霉素产生菌 13400即p Wis54-1255 转化菌株 青霉素Ⅴ产量提高40%
增加IPNS基因提高青霉素产量 转化青霉素产生菌 Wis54-1255 转化菌株 青霉素V产量提高40%
例2.头孢菌素C生物合成的限速酶 在头孢菌素C的工业发酵生产中,人们发现发酵结束后在得到 的发酵液中,除了主要产物是头孢菌素C外,在发酵液中还积累另 一种产物青霍素N。 问题:积累中间产物青霉素N 原因:下一步反应为限速酶反应 解决:导入额外的扩环酶羟化酶基因 结果:使头孢菌素C的产量提高25-50%,积累的青霉素N消失
例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶 在头孢菌素C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到 的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素C外，在发酵液中还积累另 一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N 原因：下一步反应为限速酶反应 解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结果：使头孢菌素C的产量提高 25-50%， 积累的青霉素N消失
增加限速酶基因提高头孢菌素C产量 -)转化 Cacremonium9 转化后菌株 头孢菌素C产量提高25-50%
增加限速酶基因提高头孢菌素C产量 转化C.acremonium394-4 转化后菌株 头孢菌素C产量提高25-50%
增加限速酶的其它例子-3: 例3 十一烷基灵菌红素产生菌:天蓝色链霉菌 S. colicolora3(2) acetyl CoA 构建重组质粒带甲氧基转移酶) polyketide path OH 转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株 S-腺苷甲硫氨酸 氧甲基转移酶 十一烷基灵菌红素产量提高5倍 OCH3 (CH2)10CH3
增加限速酶的其它例子-3: 例3. 十一烷基灵菌红素 产生菌:天蓝色链霉菌S.colicolorA3(2) N OH H N (CH2 )1 0CH3 H N N OCH3 H N (CH2 )1 0CH3 H N acetyl CoA polyketide pathway S-腺苷甲硫氨酸 氧甲基转移酶 构建重组质粒(带甲氧基转移酶) 转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株 十一烷基灵菌红素产量提高5倍
增加限速酶的其它例子-4: 例4.泰洛星( Tylosin)产生菌:弗氏链霉菌( Sfradiae) acetyl CoA+ malonyl CoA 构建重组质粒(带甲氧基转移酶) polyketide pathway 大菌素( macrocin 甲氧基转移酶 转化到弗氏链霉菌( S fradiae) Tylosin 转化菌株 泰洛星( Tylosin)产量显著提高
增加限速酶的其它例子-4: 例4. 泰洛星 (Tylosin) 产生菌:弗氏链霉菌 (S.fradiae) acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway 大菌素（macrocin) 甲氧基转移酶 Tylosin 构建重组质粒(带甲氧基转移酶) 转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae) 转化菌株 泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高
2增加正调节基因,去除负调节基因 调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正 调节促进生物合成结构基因的转录,负调节阻扼结构基因 的转录。 将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株 中,由于转录功能的增强,使生物合成结构基因得以高水 平的表达,提高了代谢产物的产量 反之,对于负调节基因,通过基因工程的手段,将其 祛除或失活,就能解除阻扼作用,同样导致使生物合成结 构基因高水平的表达,提高代谢产物的产量
2.增加正调节基因, 去除负调节基因 调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正 调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因 的转录。 将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株 中，由于转录功能的增强，使生物合成结构基因得以高水 平的表达，提高了代谢产物的产量。 反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其 祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结 构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量