基因组文库
基因组文库
具有代表性的基因大库 ◆基因文库一是来自于某种生物的不同 DNA序列的集合 ■基因组文库一用于构建文库的DNA来源于基 因组DNA CDNA一用于构建文库的DNA是mRNA群体的 拷贝(CDNA),则该文库称之为CDNA文库 ◆具有代表性的基因文库应该在最大限度 上覆盖所有的原始序列
具有代表性的基因文库 基因文库—是来自于某种生物的不同 DNA序列的集合 n 基因组文库—用于构建文库的DNA来源于基 因组DNA n cDNA—用于构建文库的DNA是mRNA群体的 拷贝（cDNA），则该文库称之为cDNA文库 具有代表性的基因文库应该在最大限度 上覆盖所有的原始序列
文库大小 ◆以最大可能可获得某一特定序列的基因文库 所必须包含的重组体数的计算方式如下 N=In(1-p/In(l-f) P一给定的概率,f插入片段大小占总基因组大小的 比例 如果给定概率为0.99,插入片段为20kb的情况下, 对人类基因组(3X109bp)来说,所需重组体的 数目为69X105;而对于大肠杆菌而言,仅需要 1100个重组体
文库大小 以最大可能可获得某一特定序列的基因文库 所必须包含的重组体数的计算方式如下 N＝ln(1-p)/ln(1-f) P—给定的概率，f—插入片段大小占总基因组大小的 比例 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下， 对人类基因组（3Χ109bp）来说，所需重组体的 数目为6.9 Χ 105；而对于大肠杆菌而言，仅需要 1100个重组体
◆因此,插入大小仅有5-10kp的质粒就可 以很妤地构建原核生物的基因组文库, 因为只需要几千个重组体就够了 ◆而对于较大的基因组,较大的插入片段 可以使所需的重组体数量减少,这也正 是开发黏粒以及YAC载体的原因
因此，插入大小仅有5－10kp的质粒就可 以很好地构建原核生物的基因组文库， 因为只需要几千个重组体就够了 而对于较大的基因组，较大的插入片段 可以使所需的重组体数量减少，这也正 是开发黏粒以及YAC载体的原因
基因组DNA ◆为了构建具有代表性的基因文库,必须将纯化 后的基因组DNA进行随机切割,产生适合克隆 进所有载体的大小合适的片段 ◆真核生物基因组DNA的提取 提取细胞核一为了防止器官(叶绿体、线粒体) DNA的污染 蛋白酶降解及分相抽提一去除蛋白质、脂类以及其 他的大分子条质 ◆原核细胞基因组DNA的提取 直接抽提DNA
基因组DNA 为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化 后的基因组DNA进行随机切割，产生适合克隆 进所有载体的大小合适的片段 真核生物基因组DNA的提取 n 提取细胞核—为了防止器官（叶绿体、线粒体） DNA的污染 n 蛋白酶降解及分相抽提—去除蛋白质、脂类以及其 他的大分子杂质 原核细胞基因组DNA的提取 n 直接抽提DNA
◆经提取的基因组DNA是由染色体断裂而 成的数百kp大小的长片段构成 ◆长片段的进一步切割 ■物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪切 可以非常随机地进一步将长片段切割成小片 段,片段末端通常都是平末端 限制性酶解一位点非随机分布
经提取的基因组DNA是由染色体断裂而 成的数百kp大小的长片段构成 长片段的进一步切割 n 物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪切 可以非常随机地进一步将长片段切割成小片 段，片段末端通常都是平末端 n 限制性酶解—位点非随机分布
基因组DNA片段的限制性内切酥酥解 ◆使用限制性内切酥酶解基因组DNA可产 生非随机片段,为了获得15-25kb的或 更大的基因组DNA片段(适用于A噬菌 体或黏粒载体的片段),需要进行部分 酶解。即通过合理使用限制性内切酶 (种类和用量),调节酶切片段的大小 ◆合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳或 蔗糖梯度纯化回收
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产 生非随机片段，为了获得15－25kb的或 更大的基因组DNA片段（适用于λ噬菌 体或黏粒载体的片段），需要进行部分 酶解，即通过合理使用限制性内切酶 （种类和用量），调节酶切片段的大小 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳或 蔗糖梯度纯化回收
载体 ◆质粒 较小的 大腸杆,用质粒载体来构建基因组文 库,只需5000个克隆就可以达到高于99 %的覆盖率 ◆构建较大的基因组文库 *九噬菌体最大可插入片段,23kb 黏粒45kb 细菌人工染色体(BAC)—350kb 酵母人工染色体(YAC)—1000kb
载体 质粒载体—用于基因组较小的生物，如 大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文 库，只需5000个克隆就可以达到高于99 ％的覆盖率 构建较大的基因组文库 n *λ噬菌体—最大可插入片段，23kb n 黏粒—45kb n 细菌人工染色体（BAC）—350kb n 酵母人工染色体(YAC)—1000kb
基因组DNA文库的构建流程 Genomic Library 提取 Genomic dNA Randomly cut 气三三 蓬合 转化 Ligate Transform ③e
基因组DNA文库的构建流程 提取 切割 整合 转化
质粒载体 ○Oo
质粒载体