安徽医学2009年第30卷第1期Anhui Medical Joumal Vol.30.No.11,Nov.2009 1337 ·检验与临床· 一种快速简便测定奶粉中蛋白质的方法 张梓乔沈国栋王钢 〔摘要】目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用C (二唑啉甲酸)法，在570m波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度 值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0~？50m范围内标准曲线呈线性关系，其回归 方程为：Y=301.12X-3.42,相关系数r=0.998,平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白 质的快速检验和掺伪检验。 [关键词]奶粉：蛋白质：BCA法：三氯乙酸：三聚氰胺 doi:10.3969/.iss/1000-0399.2009.11.032 A rapid and simple method of protein determination in powdered milk Zhang Zhigiao,Shen Guodong.Wang Gang First Middle School of Hefei,Anhui Provincial Hospital Affilinted to Anhui Medical Unirersity,Hefei1 [Abstract]Objective Toxporea rapid and simple method of protein determination in powdered milk without othernitrogen-co taining compound disturbance in Kjeldahl determination.Methods Conjugated with proein precipitation with trichloroacetic aid,BCA (bicinchoninie idmethod was used.According to the postiveretionhiofponwith the570nmabnce proteno was calculated in powdered milk.Results Protein content in milk solution showed a good linear relationship at the detection ranges of 0- 250 ug/ml,with regression quation:Y=301.12X-73.42 and related coefficient:.998 and the average recovery mte was 100.2%. Conclusion BCA method conjuated with trichloroacetie acid is adaptable to the rapid and sese determination of protein in powdered [Key words]Powdered milk:Protein:BCA method:Trichloroacetic acid:Melamine 蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋 STRUMENTS公司)，96孔微孔板，化学分析滤纸（直 白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质 径：9cm,最大孔径：l0m,杭州新华纸业有限公司) 定量方法较多，如凯氏定氨法、紫外分光光度法和 玻璃漏斗、烧杯等。 L0wy法等。虽然凯氏定氨法目前是测定蛋白质含量 1.1.2试剂光明全脂速溶奶粉（黑龙江省光明松 的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是 鹤乳品有限责任公司，产地：齐齐哈尔，生产日期 通过测定氨的含量推算得来的，容易被其他含氮物质 20081010),蒙牛学生多维高钙高锌奶粉（内蒙古伊不 干扰（如2008年9月“问题奶粉”的出现源于有人利 实业集团股份有限公司，产地：呼和浩特，生产日期： 用凯氏定氨法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋 20081207),尿素（分析纯，上海苏懿化学试剂有限公 白质含最虑高)：L0w法和紫外分光光度法存在显色 司)，三聚氯胺（化学纯，上海凌峰化学试剂右限公 所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点 。为弥补 司)，硝酸铵（分析纯，汕头市西能化工厂有限公司 这些不足，本实验利用BCA(二喹啉甲酸)法结合三氯 三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），BS 乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含 (牛血清清蛋白，美国Sigma公司)BCA试剂盒 量的方法。 (PIERCE公司，BCA23225),去离子水 1材料与方法 1.2实验方法 1.2.1方法原理据资料介绍，BCA法是目前已知 1.1仪器与试剂 的一种敏感准确的蛋白质测试法，广泛用于国内外企 1.1.1仪器酶标仪（型号ELX800,B10-TEKN. 业和科研院所进行蛋白质含量检测。其主要原理是： 作者单位：20会二声婆者实蜜（花国作）
安徽医学 2009年第 30卷第 11期 AnhuiMedicalJournalVo1．30．No．11，Nov．2009 一 种快速简便测定奶粉 中蛋白质的方法 张梓乔 沈国栋 王 钢 l337 · 检验与临床 · [摘 要] 目的 尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法 使用三氯乙酸沉淀蛋 白质后，运用 BCA (二喹啉甲酸)法，在 570nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度 值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果 待测溶液中蛋白质浓度在 0—250 ml范围内标准曲线呈线性关系，其回归 方程为：Y=301．12X一73．42，相关 系数 r=0．998，平均 回收率 为 100．2％ 。结论 结合 三氯 乙酸沉 淀 的 BCA法适用 于奶粉 中蛋 白 质的快速检验和掺伪检验。 [关键词] 奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺 doi：10．3969／j．issn／1000—0399．2009．11．032 A rapid and sim plemethod ofprotein determination in powdered milk Zhang Zhiqiao，Shen Guodong，Wang FirstMiddleSchoolofHefei，AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUnwe~ity，Hefei230001 [Abstract] Objective Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen—con— tainingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination．Methods Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid，BCA (bicinchoninicacid)methodwasused．Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance，proteincontent wascalculated inpowderedmilk．Results Proteincontentin milksolution showed agoodlinearrelationship atthe detection rangesof0— 250 g／ml，withregressionequation：Y=301．12X一73．42andrelatedcoeficient：0．998，andtheaveragerecoveryratewas100．2％ ． Conclusion BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowdered milk． 。 [Keywords] Powderedmilk；Protein；BCAmethod；Trichloroaceticacid；Melamine 蛋白质是人类最重要的营养物质之一 。因此 ，蛋 白质含量一直是食品检测中的重要指标 。目前蛋 白质 定量方法较 多，如 凯 氏定 氮法 、紫外分 光 光度 法 和 Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量 的国家标准方法 ，但其操作繁琐费时 ，且蛋 白质含量是 通过测定氮的含量推算得来 的，容易被其他含氮物质 干扰(如 2008年 9月 “问题奶粉”的出现源于有人 利 用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶 中添加三聚氰胺造成蛋 白质含量虚高)；Lowry法和紫外分光光度法存在显色 所需时间长，灵敏度低 ，稳定性 差等缺点 J。为弥补 这些不足 ，本实验利用 BCA(二喹啉甲酸 )法结合三氯 乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋 白质含 量的方法。 1 材料与方法 1．1 仪器与试剂 1．1．1 仪器 酶标仪 (型号 ELX800，BIO—TEKIN一 作者单位 ：230001 合肥市第一 中学(张梓 乔 ，王钢) 230001 合肥 安徽省立医院分子实验室(沈国栋) STRUMENTS公司 )，96孔微孔板 ，化学分 析滤纸 (直 径 ：9cm，最大孔径 ：10Ixm，杭州新华纸业有限公司)， 玻璃漏斗、烧杯等。 1．1．2 试剂 光 明全脂 速溶奶 粉 (黑龙江省光 明松 鹤乳 品有 限责 任 公 司，产 地 ：齐齐 哈 尔 ，生 产 日期 ： 20081010)，蒙牛学生多维高钙高锌奶粉 (内蒙古伊利 实业集团股份有 限公 司，产地 ：呼 和浩 特 ，生 产 日期 ： 20081207)，尿素 (分析纯 ，上海苏懿化学试剂 有限公 司)，三聚氰 胺 (化学 纯 ，上海 凌 峰化 学试 剂 有 限公 司)，硝酸铵(分析纯 ，汕头市西 陇化工厂有 限公 司)， 三氯乙酸(分析纯 ，国药集 团化学试剂有限公司)，BSA (牛 血 清 清 蛋 白，美 国 Sigma公 司 )BCA 试 剂 盒 (PIERCE公司 ，BCA23225)，去离子水 。 1．2 实验方法 1．2．1 方法原理 据资料介 绍 ，BCA法是 目前 已知 的一种敏感准确 的蛋 白质测试法 ，广泛用于 国内外企 业和科研院所进行蛋 白质含量检测。其主要原理是 ：
1338 安撤医学2009年第30卷第11期Anhui Medical Joumal Vol.30.No.11,Nov.200g 要分析的蛋白质在碱性溶液里与Cu2·反应产生Cu· 离心30min.吸取上清液待测：以9g/L氯化钠溶液为 Cu与BCA形成一种紫色化合物，其吸收峰在562nm 空白对照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清 波长处。BCA法定量分析蛋白质具有准确灵敏(20 液各25μl加入微孔板上相应的各个微孔中，每孔还 2000ug/ml)、快速（约40min)、稳定和经济实用（可 加人200ulAB(10A:1B)混合液60℃水浴30mim.用 以用试管或微孔板叫定)，以及它是反应物与蛋白质 燕标仪在570m波长下利定各个微孔中落液的吸光 直接作用，对铵盐类等含氯化合物的抗干扰能力较强 度，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度 等特点。 表2待测样品组成 三氯乙酸沉淀蛋白质的主要原理：三氯乙酸作为 样品序号 奶粉质量 茶加物 添加物 添加物质量 蛋白质变性剂可使蛋白质构象发生改变，暴露出较多 (mg) 含氨量 (mg) 的疏水基团，使之聚集沉淀。据文献报道 150 无 三氯乙酸 0.0% 0 150 硝酸铵 35.0% 硫酸匍等物质能更好地排除非蛋白复对溶液中蛋白氨 150 三聚氰胺 66.7毫 20 的影响，具有广泛的话用性。 4 150 尿素 45.2 1.2.2标准应用曲线的绘制 配制2mg/ml牛血清 300 0.0% 清蛋白(BSA)溶液作为标准蛋白质储存液（含有9g 300 硝酸钱 35.0% L氢化钠)，参照BCA试剂合说明书所示方法，按表 00 三策胺66.7 所示配制不同浓度BSA工作液，用定性滤纸过滤，收 300 尿素 45.2% 20 集滤液并记录体积，取其中200 山滤液加入等体积的 ,2.4分析结果的表术与计算样品中蛋白质的含 10%三氯乙酸溶液.充分反应后12000r/min离心30 量X按式(1)计算：X=10C·F(1),式中：X -样品 min,吸取上清液待测：以9/L氯化钠溶液为空白对 蛋白质的含量，g/100ml(g),C-测定样品溶液中蛋白 照，吸取上述滤液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各 25 质含量(mg/ml),F-稀释倍数 以加入微孔板上相应的各个微孔中 每孔还加入200 .2.5 允许差同一样品的两次测定结果之差，不得 ulA液与B液(10A:1B)的混合工作液.60℃水浴30 超过平均值的51% min,用酶标仪在570nm波长下测定各个微孔中溶液 2结果 的吸光度，以吸光度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横 标，计算标准回归方程并绘制工作曲线 2.1 标准工作曲线及线性范围以BSA各级工作液 表1不同浓度BSA工作液的配方 的蛋白质浓度(Y,ugoL)对其OD值(X)作图，结 BSA了作液 稀释液 BSA浓店 工作液序号 果表明蛋白质浓度在0-250μg/ml范围内标准工作 ug/ml) 曲线呈线性关系，标准曲线方程：Y=301.12X-73. 100储存液 20 42,相关系数r=0.998。见附图 400A 20 300B 450 D 400g 400 25 100D 400 5 0 00 0 1.2.3样品制备与测定准确称量牛奶粉150mg 份和300mg/份各4份，分别倒入贴有1、2、3、4、5、6 06070809 7,8标签的8个50ml离心管中，再分别称量20mg的 硝酸铵、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒人对应的 附蛋白质含量测定的标准曲线 离心管中。加入活量60℃9/L氢化钠溶液充分溶 2.2样品测定中干扰因素的影响 取上述添加了不 解.并用100ml容量定容至刻度。用定性油纸过 同干扰物质的样品，按上述实验方法进行操作，结果发 滤，收集滤液并记录体积，取其中200山滤液加入等 现，在60℃的水中三聚氰胺等添加物质都能充分溶 体积的10%三氯乙酸溶液，充分反应后12000r/min 解，只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺的奶粉
1338 安徽 医学 2009年第 30卷第 11期 AnhuiMedicalJournalVo1．30．No．11，Nov．2009 要分析的蛋 白质在碱性溶液里与 cu 反应产生 cu ， cu 与 BCA形成一种紫色化合物 ，其吸收峰在 562nm 波长处 。BCA法定量分析蛋 白质具有准确灵敏(20～ 2000 m1)、快速(约 40min)、稳定 和经济实用 (可 以用试管或微孑L板测定)，以及它是反应 物与蛋 白质 直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强 等特点。 三氯乙酸沉淀蛋 白质 的主要原理 ：三氯 乙酸作为 蛋白质变性剂可使蛋 白质构象发生改变 ，暴露出较多 的疏水基团，使之聚集沉淀。据文献报道 ，三氯乙酸 比 硫酸铜等物质能更好地排除非蛋 白氮对溶液中蛋 白氮 的影响 ，具有广泛的适用性。 1．2．2 标准应用曲线 的绘制 配制 2mg／ml牛血清 清蛋 白(BSA)溶液作为标准蛋 白质储存液 (含有 9g／ L氯化钠)，参照 BCA试剂盒说明书所示方法，按表 I 所示配制不 同浓度 BSA工作液 ，用定性滤纸过滤 ，收 集滤液并记录体积 ，取其 中200 滤液加人等体积的 10％三氯 乙酸溶液 ，充分反应后 12000r／min离心 30 min，吸取上清液待测 ；以 9g／L氯化钠溶液 为空 白对 照 ，吸取上述滤液及其三氯 乙酸沉淀后 的上清液各 25 l加入微孔板上相应 的各个微孔 中，每孔还加入 200 1A液与 B液 (IOA：IB)的混合工作液 ，60℃水 浴 30 min，用酶标仪在 570nm波长下测定各个微孔 中溶液 的吸光度 ，以吸光度为纵坐标 ，蛋白质质量浓度为横坐 标 ，计算标准回归方程并绘制工作曲线。 表 1 不 同浓 度 BSA工作液 的配方 1．2．3 样 品制备与测定 准确称量牛奶 粉 150mg／ 份和 300mg／份各 4份 ，分别倒入贴有 1、2、3、4、5、6、 7、8标签 的 8个 50ml离心管中，再分别称量 2Omg的 硝酸铵 、三聚氰胺和尿素各 2份 ，按表 2示倒人对应 的 离心管中。加入适量 60℃ 9g／L氯化钠溶液 充分溶 解 ，并用 100ml容量瓶定容 至刻度。用定性滤 纸过 滤 ，收集滤 液并记录体积 ，取其 中 200 l滤液加入等 体积的 10％三氯 乙酸溶液 ，充分反应后 12000r／min 离心 30min，吸取上清液待测 ；以 9g／L氯化钠溶液为 空 白对照 ，吸取上述滤液及其 三氯 乙酸沉淀后的上清 液各 25 l加入微孔板上相应的各个微孔 中，每孔 还 加入 200txlAB(10A：1B)混合液 ，60％水浴 30min，用 酶标仪在 570nm波长下测定各个微孔 中溶液的吸光 度 ，从标准工作曲线上查出对应的蛋白质浓度。 表 2 待测样 品组成 1．2．4 分析结果的表述与计算 样品 中蛋 白质的含 量 x按式 (1)计算 ：X=10C·F(1)，式 中：x一样品中 蛋 白质的含量 ，g／100ml(g)，C一测定样品溶液中蛋白 质含量(mg／m1)，F一稀释倍数。 1．2．5 允许差 同一样品的两次测定结果之差 ，不得 超过平均值的 5l％。 2 结果 2．1 标准工作 曲线及线性范 围 以 BSA各级工作液 的蛋 白质浓度 (Y，IxgmoL )对其 OD值 (x)作图 ，结 果表明蛋 白质浓度在 0—250 ml范 围内标准工作 曲线呈线性关 系 ，标准 曲线方程 ：Y=301．12X一73． 42，相关系数 r=0．998。见附图。 01 0．2 03 0．4 05 0．6 07 08 0．9 10 OD 附图 蛋 白质含量测定的标准曲线 2．2 样品测定中干扰因素 的影响 取上述添加 了不 同干扰物质 的样品 ，按上述实验方法进行操作 ，结果发 现 ，在 60℃ 的水 中三 聚氰胺 等添加物质都 能充分 溶 I 解，只是过滤速度表现不一样：添加了三聚氰胺的奶粉 狮 伽 伽 ∞ 0 一E夸 一vs∞
安撤医学2009年第30卷第11期Anhui Medical Joumal Vol.30.No.1山，Nov.2009 1339 溶液过滤速度最快(3号和7号管分别用时为19min 种含氨化合物后平均蛋白质含量为35,72mg,标准 和21mi).添加了尿素的奶粉溶液次之(4号和8号 差为1.38mg:质量300mg的奶粉添加三种含氮化合 管分别用时为79min和92min),添加了硝酸铵的奶 物后平均蛋白质含量为62.13mg,标准方差为1.4 粉溶液最慢(2号和6号管分别用时为112min和124 mg:分别与空白对照的34.96mg和65.56mg,以及】 min). 家奶粉中蛋白质标示量36mg和72mg相比，二者差 分别收集滤液和三氯乙酸沉淀后的上清液进行 异都不明显。同时实验结果也表明木实验所用奶粉的 BCA法检测蛋白质含量，测得各项实验数据如表3 蛋白质含量达到国家要求（我国《食品营养标签管理 结果发现三种不同的非蛋白质的含氮化合物基本不影 规范》的技术附件中规定，对于蛋白质和碳水化合物， 响蛋白质含量的正确测定：质量150mg的奶粉添加三 其允许的误兰范间是≥80%标示值】 表3不同样品蛋白质含量定 样品号 滤渣质量滤液体积滤液中蛋白质含量 上清液蛋白质含量 测定蛋白质质量 标示蛋白质质量 （m 《gm (mg) (mg) 0.0 3 2到 66 32 28 3 677 23569 6365 2 0.01 n8 2321.28 109.92 61.92 2.3方法的加标回收率分别取奶粉1（光明全脂速 6.4g,因而楼伪问腰容易受到人们的忽视 溶好粉，其稀释液为稀释液1)和奶粉2（装牛学生多组 国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含昂 高钙高锌奶粉，其稀释液为稀释液2)加人60℃9g/1 测定方法的研究，例如，云南工业大学张惠芬等探讨 氯化钠溶液进行1/1000样品稀释，做方法加标回收试 在奶粉、豆奶粉、鱼粉中人为修人尿素、硫酸铵等含氮 验，结果见表4，该方法的平均加标回收率为100.2%。 化合物对蛋白质测定的影响，结果表明：用95%乙 表4方法的加标回收率 能很好地将尿素与食品中蛋白进行分离，回收率较高 样品名称 本底蛋白质加人蛋白质 实测结果 回收率 并能方便、快速测定摻入量。对人硫酸铵等无机铵 （mg () 盐的测定，采用加Mg0调到弱碱性，直接蒸馏测定 稀释液 成都理工大学李海玲等通过对Lowry法、BCA法、磺基 020 水杨酸沉淀法、Bradford法等4种常用蛋白浓度测定 稀液 0.24 0.10 0.35 02.9 方法的研究认为，确定PEG-L-6的最佳蛋白浓度 0.24 0.46 104.5 测定方法为BCA法，而包涵体变性液中的蛋白浓度只 稀释液2 0.24 02 0.52 063 能用Bradfor法测定 中国农业大学食品科学与营 养工程学院华魏等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸 3讨论 沉淀蛋白法对添加了非蛋白氨的液态奶进行蛋白氮测 奶粉中蛋白质含量是奶粉检验工作的 -项重要扑 定。结果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋 标。目前国内主要采用常规凯氏定氨法，国外也多采 白氮对液态奶蛋白氮测定的影响 河北省衡水市 用常想或改良的凯氏定氯法测定食品中蛋白质含量 疾质痕所榜制中、出志瓶辞分卧别云用茗外升此光博 但此法费时、费水、费电，操作繁琐，试剂消耗量大，且 及甲醛值滴定法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量 不能有效区分非蛋白氨2 常见的含氨化合物如硝 结果显示，两种方法均可有效解决非蛋白质类含氮名 酸铵和尿素比牛奶蛋白质的含氨率都高，易溶于水，很 质对牛奶中蛋白质定结果的干扰问题 ,中国衣 容易擒人奶粉等食物中：而三聚氰胺虽然常温和羚水 业大学侯彩云等使用三氢乙酸使蛋白质沉淀后，不同 状况下在水中的溶解度非常低，但是人们平时习惯 含量的蛋白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不 上和奶粉说明书上都要求用温开水冲调，例如60℃时 同的蓝紫色的络合物，根据其色度值与蛋白氮含量高 三聚瓢按在100g水中可以溶解1.8g,100℃时溶解 低呈线性相关关系，用计算机软件自动分析获得的样
安徽 医学 2009年第 30卷第 11期 AnhuiMedicalJournalVo1．30．No．11，Nov．2009 溶液过滤速度最快 (3号和 7号管分别用时为 19min 和 21min)，添加了尿素的奶粉溶液次之 (4号和 8号 管分别用时为 79min和 92min)，添加了硝酸铵的奶 粉溶液最慢(2号和 6号管分别用时为 112min和 124 min)。 分别收集滤液 和三氯乙酸沉淀 后的上清液进行 BCA法检测蛋 白质含 量 ，测得 各项实验 数据如 表 3。 结果发现三种不同的非蛋白质的含氮化合物基本不影 1339 种含氮化合物后平均蛋 白质含量为 35．72mg，标准方 差为 1．38mg；质量 300mg的奶粉添加 三种含氮化合 物后平均蛋 白质含 量为 62．13mg，标准方差 为 1．43 mg；分别与空 白对照的 34．96mg和 65．56mg，以及厂 家奶粉 中蛋 白质标示量 36mg和 72mg相 比，二者差 异都不明显。同时实验结果也表明本实验所用奶粉的 蛋 白质含量达到 国家要求 (我国《食 品营养标签管理 规范》的技术附件 中规定 ，对于蛋 白质和碳水化合物 ， 响蛋白质含量的正确测定 ：质量 150mg的奶粉添加三 其允许的误差范围是 1>80％标示值)。 表 3 不 同样 品蛋 白质含量 测定 2．3 方法的加标 回收率 分别取奶粉 l(光明全脂速 溶奶粉，其稀释液为稀释液 1)和奶粉 2(蒙牛学生多维 高钙高锌奶粉 ，其稀释液为稀释液 2)加人 6&C9g／L 氯化钠溶液进行 1／1000样 品稀释，做方法加标 回收试 验 ，结果见表 4，该方法的平均加标回收率为 100．2％。 表 4 方法的加标 回收率 3 讨 论 奶粉 中蛋 白质含量是奶粉检验工作的一项重要指 标。目前国内主要采用常规凯 氏定氮法 ，国外也多采 用常规或改良的凯 氏定氮法测定食品 中蛋 白质含量 ， 但此法费时、费水 、费电，操作繁琐 ，试剂消耗量大 ，且 不能有效区分非蛋 白氮 。常见的含 氮化合物如硝 酸铵和尿素比牛奶蛋 白质的含氮率都高，易溶于水 ，很 容易掺入奶粉等食物中；而三聚氰胺虽然常温和冷水 状况下在水 中的溶解度非常低 J，但是人们平时习惯 上和奶粉说明书上都要求用温开水 冲调 ，例如 60℃时 三聚氰胺 在 100g水 中可 以溶解 1．8g，100oC时溶解 6．4g，因而掺伪问题容易受到人们的忽视。 国内已有多篇文献涉及有关乳制品中蛋白质含量 测定方法的研究 ，例如 ，云南工业大学张惠芬等探讨 了 在奶粉、豆奶粉 、鱼粉 中人为掺入尿素 、硫酸铵等含氮 化合物对蛋 白质测定 的影响 ，结果 表明 ：用 95％ 乙醇 能很好地将尿素与食 品中蛋 白进行分离 ，回收率较高 ， 并能方便 、快速测定掺入量 。对掺入硫酸铵等无机铵 盐的测定 ，采用加 MgO调到弱碱性 ，直接蒸馏测定 J。 成都理工大学李海玲等通过对 Lowry法 、BCA法 、磺基 水杨酸沉淀法 、Bradford法等 4种 常用蛋 白浓度 测定 方法的研究认 为，确定 PEG—IL一6的最佳蛋 白浓度 测定方法为 BCA法 ，而包涵体变性液 中的蛋 白浓度只 能用 Bradford法测定 J。中国农业大学食 品科学与营 养工程学院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋 白法和硫酸铜 沉淀蛋 白法对添加了非蛋 白氮的液态奶进行蛋白氮测 定。结果表明 ，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋 白氮对液态奶蛋 白氮测定 的影 响 j。河北 省衡水 市 疾病预防控制中心田志梅等分别运用紫外分光光度法 及甲醛值滴定法快速测定液体奶 、奶粉中蛋 白质含量 。 结果显示 ，两种方法均可有效解决非蛋 白质类含 氮物 质对牛奶 中蛋白质测定结果的干扰 问题_8J。中国农 业大学侯彩云等使用三氯乙酸使蛋 白质沉淀后 ，不 同 含量 的蛋 白氮在碱性条件下与双缩脲试剂形成深浅不 同的蓝紫色的络合物 ，根据其色度值与蛋 白氮含量高 低呈线性相关关系，用计算机软件自动分析获得的样
1340 安微医学2009年第30卷第11期Anhui Medical Joumal Vol.30.No.1L,Nov.2009 复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义 李成张强 [摘要]目的探讨不明原因复发性流产患者外周血以CD4~CD25-CD127-Teg(CD4CD25-"CD127 T regular ©s)为代表的调节性T细胞表达及其意义。方法采用三色荧光抗体标记及流式细胞术分析20例不明原因复发性流产患者、正 常妊振组和正常非孕对照组外周血CD4·CD25-“CD127-Teg占CD4+T淋巴细胞的比例。结果正常孕妇外周血CD4 CD25t-CDI27Teg较正常对照组差异有统计学意义(P0.05) 结论原因不明复发性流产患者外周血中调节T细胞此例降低，这种改变导致原因不明复发性流产患者细胞免疫耐受被打破，可 能是原因不明复发性流产患者发病的重要原因之 「关键逼】复发性流产：调节性T细胞：流式细胞术 di:10.3969/.isn/1000-0399.2009.11.033 ment of regulation Tce in peripheral blood of patients spontaneous abortion i Cheng,Zhar Qiang the expression Cells)in the periph (PB tients with nt spon (URSA to exploreth eha in URSA. e pro on of CD4 D127Treg in the PB of thr se groups of peopl URSA patien they had be non -pregnant w d the no al pregr an anal by tnad beled monoclonal antibody and using multip low cytometry.Results The propo of CD4'CD25 CD127 Treg/T CD4 cells in the normal pregnant woman was significantly higher htan those in cono group(P.01);the proportion of CD4 CD25CD127Treg/TCD4cells in URSA patients was significantly lower than those in control group(P<.01).Conclusion The ntages of CD4'CD25CD127Treg was decreased,which break down the autoimmune tolerance in URSA,these changes of CD4 CD25CD127Treg in number might participate in onet of URSA,it may be coeed to pathogenesis of URSA. 作者单位：233000蚌埠市第二人民医院检验科 品色度值，从而计算出蛋白氮含量 与词料工业.2004.(1)：45-45. 综上所述，目前国内用于测定奶粉中蛋白质含量 [4]钟金国.废三聚氰胺的同收处理.川化，2003，（3)：8-10. 的方法有多种，其测定原理及结果的准确性各不相同， 张惠芬，段云魅，含氮化合物食品中蛋白质的检测 每种方法都有其优点及局限性。相比较而言，本项目 食品利 运用BCA法结合三氯乙酸沉淀蛋白法检测奶粉中蛋 [6 李海玲，彭书明，李凛，等。4种常用蛋白浓度测定方法的 白质的含量，可以有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干 比较.中国生化药物杂志，2008,29(4)：277-278. [7]牛巍侯彩云，祝晓芳，等.三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀 扰，具有简便、快速、准确、实用的特点，可作为检测机 法在液态奶蛋白质检测中适用性研究.中国乳品工业， 构和平时人们准确检测蛋白质含量时考虑运用的方法 2008,36(9):59-61. 之一。 [8]田志梅，张水顺.兼外分光光度法快速测定液体奶，奶粉 中蛋白质含量.中国卫生检验杂志.2008.18(2)：263 参考文献 2K4 [1】石磊，黄德盈，吴士筠.一种快速豪价的蛋白质测定方法. 9] 田志梅甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量，中国 分析测试学报，1999,18(3)：61-63. 食品卫4生条志208,20(3)：24-245 [2】刘玉兰，李珊，刘坤.食品中蛋白质含量测定方法的改进 [10]侯彩云，孙建平.乳粉蛋白质数字图像检测方法的研究。 和应用.青岛医学院学报，1999,35(2)：123-124. 中国乳品工业.2005,33(5)：46-48. [3】徐杰，苏立新.蛋白质测定过程中的几个关继环节.粮食 (200909-20收稿)】
1340 安徽 医学 2009年第 30卷第 11期 AnhuiMedicalJournalVo1．30．No．11，Nov．2009 复发性流产患者外周血调节性 T细胞检测及 临床意义 李 成 张 强 [摘 要] 目的 探讨不明原因复发性流产患者外周血以 CD4 CD25gh.‘CD127 Treg(CD4 CD25gh CD127 Tregular cells)为代表的调节性 T细胞表达及其意义。方法 采用三色荧光抗体标记及流式细胞术分析 20例不明原因复发性流产患者、正 常妊娠组和正常非孕对照组外周血 CIM CD25 CD127 Treg占 CIM T淋巴细胞 的比例。结果 正 常孕妇外周血 CIM CD25 CD127 Treg较正常对照组差异有统计学意义(P0．05)。 结论 原 因不 明复发性流产 患者 外周 血中调节 T细胞 比例降低 ，这 种改变导 致原 因不 明复发性 流产患 者细胞 免疫耐 受被 打破 ，可 能是原 因不 明复发性流产患者发病 的重要 原因之一 。 [关键词] 复发性流产；调节性 T细胞；流式细胞术 doi：10．3969／j．issn／1000—0399．2009．11．033 Significanceofmeasurem entofregulation T cellsin peripheralblood ofpatientswith recurrentspontaneousabo~ion LiCheng，ZhangQiang DepartmentofClinicalLaboratory，BengbuSecondPeoples&Hospital，Bengbu233000 [Abstract] Objective Toinvestigate"theexpressionandsignificanceofCD4 CD25 “一“CD127。Treg(CD4 CD25high-intCD127‘。 TRegularCells)intheperipheralblood(PB)frompatientswithunexplainedrecurrentspontaneousabortion(URSA)，toexplorethemecha— nism ofautoimmuneintolerancein URSA．M ethods Theproportion ofCD4 CD25mh_m‘CD127 Treg in thePB ofthreegroupsofpeople (URSApatientsthattheyhadbeendiagnosedclearly，normalnon—pregnantwomenandthenormalpregnantwoman)analyzedbytfadcol— ourfluoresce—labeled monoclonalantibodyandusingmultiparameterflow eytometry．Results TheproportionofCIM CD25“ CD127‘ Treg／TCD4 cellsinthenormalpregnantwomanwassignificantlyhigherhtanthoseincontrolgroup(P<0．O1)；theproportionofCIM CD25 一“‘CD127。Treg／TCD4 cellsinURSApatientswassignificantlylowerthanthoseincontrolgroup(P<0．01)．Conclusion The percentagesofCD4 CD25 . CD127 Tregwasdecreased．whichbreakdowntheautoimmunetoleranceinURSA．thesechangesofCD4 CD25 一 CD127 Tregin numbermightparticipateinonsetofURSA．itmaybe correlatedtopathogenesisofURSA． 作者单位 ：233000 蚌埠市第 二人民医院检验科 品色度值 ，从而计算 出蛋 白氮含量¨ 。 综上所述 ，目前 国内用于测定奶粉 中蛋 白质含量 的方法有多种 ，其测定原理及结果的准确性各不相同， 每种方法都有其优点及局限性。相 比较而言 ，本项 目 运用 BCA法结合三氯乙酸沉淀蛋 白法检测奶粉 中蛋 白质的含量 ，可以有效排除三聚氰胺等非蛋 白氮 的干 扰 ，具有简便 、快速 、准确 、实用 的特点 ，可作为检测机 构和平时人们准确检测蛋白质含量时考虑运用的方法 之一 。 参考文献 [2] [3] 石磊 ，黄德盈，吴士筠．一种快速廉价的蛋白质测定方法． 分析测试学报 ，1999，18(3)：61—63． 刘玉兰，李珊，刘坤．食品中蛋白质含量测定方法的改进 和应用．青岛医学院学报 ，1999，35(2)：123—124． 徐杰 ，苏立新．蛋白质测定过程中的几个关键环节．粮食 与饲料 工业 ，2004，(1)：45—45． [4] 钟金国．废三聚氰胺的回收处理．川化 ，2003，(3)：8—10． [5] 张惠芬 ，段云彪．掺含氮化合物食品中蛋 白质的检测与 测定．食品科学．1999，20(5)：44—46． [6] 李海玲 ，彭书明，李凛，等．4种常用蛋 白浓度测定方法的 比较 ．中 国生化药物杂志 ，2008，29(4)：277—278． [7] 牛巍，侯彩云，祝晓芳，等．三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀 法在液态奶蛋白质检测中适用性研究．中国乳品工业 ， 2008，36(9)：59—61． [8] 田志梅 ，张永顺．紫外分光光度法快速测定液体奶 、奶粉 中蛋白质含量．中国卫生检验杂志，2008，18(2)：263～ 264． [9] 田志梅．甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋 白质含量．中国 食品卫生杂志，2008，20(3)：244—245． [10]侯彩云，孙建平．乳粉蛋 白质数字图像检测方法的研究． 中国乳 品工业 ，2005，33(5)：46—48． (2009-09-20收稿 )