较安全：(2)载体基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达，并可激发机体产生全 面的免疫保护力，尤其是细胞免疫和黏膜免疫：(3)繁殖速度快，易于大规模培养。然 而VSV中的M蛋白具有阻止宿主细胞的mRNA从细胞核转运至细胞质的功能，从而抑制细胞产生 I型干扰素的功能，这样就能让其在宿主细胞中扩增，对宿主产生毒性，大剂量注射VSV后， 实验动物会出现神经毒性症状，如后置麻痹ao。M蛋白是VSV的重要毒力因子，本实验就 是围绕VSV的M蛋白对病毒进行改造。我们主要对病毒的M蛋白的第51位氨基酸（甲硫氨酸） 进行了敲除，对第221位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨 酸和精氨酸。通过对VSV的三个位点的突变以期降低致病性。 图1.VSV电镜图片 Fig 1.VSV stereoscan photograph 2材料与方法 2.1细胞与试剂 BHK21、Vero、细胞由本实验室保存：MluI和XhoI限制性内切酶购自NEB公司，细胞 培养用的DMEM购自Thermo公司，胎牛血清购自Gbico公司，细胞转染脂质体 Lipofectamine?2OO0购自Invitrogen,PFU高保真酶、T4连接酶和逆转录试剂盒为fermentas 公司生产，PVDF膜购自北京鼎国昌盛生物公司。 VSV挽救所需质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSV△M51和VSVinia.基因全长序列的质粒 PVSVXN2由本实验室保存。 2.2pVSV△MT质粒构建 pVSV△MT质粒构建以质粒pVSV△M51为模板，设计两对引物，利用PCR分别扩增得到 两段DAN片段。其中N端片段带入第51氨基酸（甲硫氨酸）缺失，我们将N端片段下游引 物中带入M蛋白第221为氨基酸（缬氨酸）和第226氨基酸（丝氨酸）点突变，分别突变为 苯丙氨酸和精氨酸：在C端片段，我们在上游引物中同样带入M蛋白的第221为氨基酸（缬 氨酸)和第226氨基酸（丝氨酸）点突变，N端片段的下游引物和C端的上游引物完全互补 配对，其中 N端片段的下游引物： 5'-GGGTCCTGGATTCTATCCGCCACTTCAAATG-3',而根据对称原则，添加相应的上游引物，其 C端的上游引物：5'-CATTTGAAGTGGCGGATAGAATCCAGGACCC-3'。利用重叠PCR扩增得到含有第 51位氨基酸缺失、第221氨基酸（缬氨酸）突变为苯丙氨酸和第226氨基酸（丝氨酸）突 变为精氨酸的三个氨基酸位点发生突变的M蛋白DNA序列(MT)。其中N端片段的上有引物 带有MIuI酶切位点，C端片段的下游引物带有XhoI酶切位点。得到的MT片段和同样M 蛋白位置含有M1uI和XhoI酶切位点的质粒pVSV△M51,再经T4连接酶连接得到M蛋白 含有三位点突变的质粒(pVSV△MT)。如图2所示。较安全；（2）载体基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达，并可激发机体产生全 面的免疫保护力，尤其是细胞免疫和黏膜免疫 [4] ；（3）繁殖速度快，易于大规模培养。然 而VSV中的M蛋白具有阻止宿主细胞的mRNA从细胞核转运至细胞质的功能，从而抑制细胞产生 I型干扰素的功能 [5-8]，这样就能让其在宿主细胞中扩增，对宿主产生毒性,大剂量注射VSV后， 实验动物会出现神经毒性症状，如后置麻痹 [9,10]。M蛋白是VSV的重要毒力因子 [11]，本实验就 是围绕VSV的M 蛋白对病毒进行改造。我们主要对病毒的M蛋白的第51位氨基酸（甲硫氨酸） 进行了敲除，对第221位和226位氨基酸（缬氨酸和丝氨酸）进行了突变，分别突变为苯丙氨 酸和精氨酸。通过对VSV的三个位点的突变以期降低致病性。 图 1. VSV 电镜图片 Fig 1.VSV stereoscan photograph 2 材料与方法 2.1 细胞与试剂 BHK21、Vero、细胞由本实验室保存；MluI 和 XhoI 限制性内切酶购自 NEB 公司，细胞 培 养 用 的 DMEM 购 自 Thermo 公 司 ， 胎 牛 血 清 购 自 Gbico 公 司 ， 细 胞 转 染 脂 质 体 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen，PFU 高保真酶、T4 连接酶和逆转录试剂盒为 fermentas 公司生产，PVDF 膜购自北京鼎国昌盛生物公司。 VSV 挽救所需质粒 pBS-N、pBS-P、pBS-L 及 pVSVΔM51 和 VSVindiana基因全长序列的质粒 pVSVXN2 由本实验室保存。 2.2 pVSVΔMT 质粒构建 pVSVΔMT 质粒构建以质粒 pVSVΔM51 为模板，设计两对引物， 利用 PCR 分别扩增得到 两段 DAN 片段。其中 N 端片段带入第 51 氨基酸（甲硫氨酸）缺失，我们将 N 端片段下游引 物中带入 M 蛋白第 221 为氨基酸（缬氨酸）和第 226 氨基酸（丝氨酸）点突变，分别突变为 苯丙氨酸和精氨酸；在 C 端片段,我们在上游引物中同样带入 M 蛋白的第 221 为氨基酸（缬 氨酸）和第 226 氨基酸（丝氨酸）点突变,N 端片段的下游引物和 C 端的上游引物完全互补 配 对 ， 其 中 N 端 片 段 的 下 游 引 物 ： 5'-GGGTCCTGGATTCTATCCGCCACTTCAAATG-3'，而根据对称原则，添加相应的上游引物，其 C 端的上游引物:5'-CATTTGAAGTGGCGGATAGAATCCAGGACCC-3'。利用重叠 PCR 扩增得到含有第 51 位氨基酸缺失、第 221 氨基酸（缬氨酸）突变为苯丙氨酸和第 226 氨基酸（丝氨酸）突 变为精氨酸的三个氨基酸位点发生突变的 M 蛋白 DNA 序列（MT）。其中 N 端片段的上有引物 带有 Mlu I 酶切位点，C 端片段的下游引物带有 Xho I 酶切位点。得到的 MT 片段和同样 M 蛋白位置含有 Mlu I 和 Xho I 酶切位点的质粒 pVSVΔM51，再经 T4 连接酶连接得到 M 蛋白 含有三位点突变的质粒（pVSVΔMT）。如图 2 所示