G L MT G L EM(51)D.…V(221)..S(226) ED..F(221)..R(226) 图2.野生型VSV和VSV△MT基因组结构图.N:核衣壳蛋白，P:磷酸化蛋白，M:基质蛋 白，L:RNA复制酶。VSV△MT基质蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除，第221位氨基酸一缬氨酸 突变为苯丙氨酸，第226位氨基酸一丝氨酸突变为精氨酸。 Fig 2.Genomic structure of wild-type VSV and VSVAM51.N:Nucleoprotein,P: Phosphoprotein,M:Matrix protein,L:RNA polymerase.Methionine 51 in VSV matrix protein was deleted. 2.3 Matrix蛋白三位点突变的VSV(VSV△MT)病毒的构建 按Schnell等所述方法进行VSV△MT病毒挽救。用表达T,RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感 染BHK-21细胞，接种量为MOI=5,孵育细胞一小时，同时制备质粒转染混合液，其中包括质 粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSV△MT,转染试剂Lipofectamine?2OO0加入opti-MEM培养基稀释， 放置5min,再将质粒混合液和转染试剂混合后室温放置25min。然后去除痘病毒悬液，加入 转染试剂与质粒混合液孵育48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒，将滤液加入到正 常BHK-21细胞中，观察细胞病变情况，如果细胞出现病变情况，则收集上清，进行病毒鉴定。 2.4VSV△MT病毒的鉴定 2.4.1通过RT-PCR对VSV△MT病毒进行验证 取上述收集的上清0.25ml,加入0.75ml的trizolLS,.混匀，室温放置5min,再加入 0.2ml氯仿，剧烈震荡15s,放置3min,4℃12000rpm离心15min,取上层水相。1：1体积 加入异丙醇沉淀水相中的RNA,放置10min,4℃12000rpm离心10min,去上清液，得RNA 沉淀。再加入75%的乙醇重悬RNA沉淀，4℃12000rpm离心5min,去除上清，收集RNA沉淀。 再Fermentas公司逆转录试剂盒和VSV△MT的M基因下游引物进行RT-PCR,再以RT-PCR产 物为模板进行PCR得到△MT DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳测定大小后，再送上海杰李生物 技术公司进行测序，鉴定是否为三位点突变的水泡性口炎病毒。 2.4.2VSV△MT病毒的western-blotting鉴定 将经空斑纯化后的VSV△MT病毒24h后的BK-21细胞收集起来，10000rpm离心10min 收集上清，再将上清用Hitachi超速离心机30000rpm离心30min,收集病毒，用PBS重悬 病毒，再用蛋白上样缓冲液处理，然后进行1O%SDS-PAGE凝胶电泳，再将蛋白转移至PVDF 膜，用5%的脱脂奶粉封闭两个小时，封闭完成后，用PBST洗涤三次，每次10mi,然后在4℃ 下一抗按1：1000稀释度（感染VS的猪血清）孵育过夜，PBST洗涤三次，每次10min,再 进行二抗孵育，二抗为美国sigma公司生产的兔抗猪，稀释度为1：20000。PBST洗涤三次后， 用ECL试剂盒进行显色，压片，检测VSV△MT目的蛋白。 3结果 3.1VSV△MT病毒的构建及鉴定图 2. 野生型 VSV 和 VSV ΔMT 基因组结构图.N:核衣壳蛋白，P:磷酸化蛋白，M:基质蛋 白，L:RNA 复制酶。VSV ΔMT 基质蛋白的第 51 位甲硫氨酸被敲除,第 221 位氨基酸—缬氨酸 突变为苯丙氨酸，第 226 位氨基酸—丝氨酸突变为精氨酸。 Fig 2. Genomic structure of wild-type VSV and VSVΔM51. N: Nucleoprotein, P: Phosphoprotein, M: Matrix protein, L: RNA polymerase. Methionine 51 in VSV matrix protein was deleted. 2.3 Matrix 蛋白三位点突变的 VSV（VSVΔMT）病毒的构建 按Schnell等所述方法进行VSVΔMT病毒挽救 [12]。用表达T7RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感 染BHK-21细胞，接种量为MOI=5，孵育细胞一小时，同时制备质粒转染混合液，其中包括质 粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSVΔMT，转染试剂Lipofectamine2000加入opti-MEM培养基稀释， 放置5min，再将质粒混合液和转染试剂混合后室温放置25min。然后去除痘病毒悬液，加入 转染试剂与质粒混合液孵育48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒，将滤液加入到正 常BHK-21细胞中，观察细胞病变情况，如果细胞出现病变情况，则收集上清，进行病毒鉴定。 2.4 VSVΔMT病毒的鉴定 2.4.1通过RT-PCR对VSVΔMT病毒进行验证 取上述收集的上清 0.25ml，加入 0.75ml 的 trizolLS, 混匀，室温放置 5min ，再加入 0.2ml 氯仿，剧烈震荡 15s，放置 3min，4℃12000rpm 离心 15min，取上层水相。1：1 体积 加入异丙醇沉淀水相中的 RNA，放置 10min，4℃12000rpm 离心 10min，去上清液，得 RNA 沉淀。再加入 75%的乙醇重悬 RNA 沉淀，4℃12000rpm 离心 5min，去除上清，收集 RNA 沉淀。 再 Fermentas 公司逆转录试剂盒和 VSVΔMT 的 M 基因下游引物进行 RT-PCR,再以 RT-PCR 产 物为模板进行 PCR 得到ΔMT DNA 片段，经琼脂糖凝胶电泳测定大小后，再送上海杰李生物 技术公司进行测序，鉴定是否为三位点突变的水泡性口炎病毒。 2.4.2 VSVΔMT 病毒的 western-blotting 鉴定 将经空斑纯化后的 VSVΔMT 病毒 24h 后的 BHK-21 细胞收集起来，10000rpm 离心 10min 收集上清，再将上清用 Hitachi 超速离心机 30000rpm 离心 30min，收集病毒，用 PBS 重悬 病毒，再用蛋白上样缓冲液处理，然后进行 10%SDS-PAGE 凝胶电泳，再将蛋白转移至 PVDF 膜，用 5%的脱脂奶粉封闭两个小时,封闭完成后，用 PBST 洗涤三次，每次 10min，然后在 4℃ 下一抗按 1:1000 稀释度（感染 VSV 的猪血清）孵育过夜，PBST 洗涤三次，每次 10min，再 进行二抗孵育，二抗为美国 sigma 公司生产的兔抗猪，稀释度为 1:20000。PBST 洗涤三次后， 用 ECL 试剂盒进行显色，压片，检测 VSVΔMT 目的蛋白。 3 结果 3.1 VSVΔMT 病毒的构建及鉴定