山国武论义在统 http://www.paper.edu.cn 采用荧光法检测各目标化合物体外对GSK-3β的抑制活性。使用 Invitrogen公司的 Z-LYTE测试试剂盒,GSK-3β采用从大肠杆菌中表达并纯化的全长人源重组蛋白,阳性对 照物为 staurosporine。 实验方法 (1).配制1.33×的GSK-3β缓冲液。用水稀释5×的酶缓冲液至1.33× (2).配制4×的待测化合物溶液。用4%DM0水溶液配制待测化合物溶液浓度为最终 实验所需浓度的4倍。 (3).配制酶/肽混合物。用1.3×的酶缓冲液稀释使酶浓度为实验测得最佳浓度的 倍浓度,Z’- LYTETM Se/Thr9肽浓度为4uM.。 (4).将2μLZ- LYTETM Ser/Thr9磷酸化肽加到498μL1.33×的酶缓冲液,混合 均匀。 (5).用1.33×的酶缓冲液将10 mM ATP稀释至实验浓度的4倍 (6).按照说明书的流程,正确加入各种试剂,最后加入ATP,得10μL的反应体系, 室温孵化1小时。 (7).各孔中分别加入5μ L Deve lopment溶液,得15μL的反应体系,室温孵化1小 (8).各孔中加入5μL终止液,然后检测荧光。 3.结果与讨论 本工作以GSK-3β晶体结构中的非ATP结合区为作用位点,选取TDZD与此位点作用最 密切的三个氨基酸Arg96,Lys205和Tyr216构建筛选靶点,通过对结构多样性的类药性小 分子库 Maybridge进行虚拟筛选,发现2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂-4(5-酮类化合物 (1)可能是潜在的非ATP竞争抑制剂。通过对打分结果和候选化合物结构的分析,设计并 合成了8个此类化合物的衍生物。主要考察母环2位氢被不同芳杂环取代的影响和5位氮原 子被不同取代基取代的活性变化。芳杂环选择了呋喃环和噻吩环,氮取代基选择了支链短烃 异丙基和具有一定体积和电性的苄基。合成的目标化合物结构均经核磁共振氢谱和质谱确 采用荧光法检测8个目标化合物的体外GSK-3β抑制活性,其中化合物(4c)对GSK-3 β具有微摩尔级的抑制作用,其ICo为47.69±2.38μ。测试结果亦表明,此类化合物 位氮氢如被烷基,如甲基或异丙基取代(4a,4b,4d,4e)均未显示出活性,而被苄基取 代(4c)则活性较好。由Fig.2B可以看出,5位N原子在活性腔中与Phe67邻近,在此位 置引入苄基,能有效地与受体蛋白间π-π堆积( stacking)相互作用,从而提高该抑制剂 的酶抑制活性。这与我们最初虚拟筛选时所进行的简单构效关系(SAR)分析结果一致,也 验证了我们虚拟筛选模型的合理性。而2位氢被噻吩环取代未显示岀活性(4d-4f),呋喃 环取代则显示出有活性(4c)。在此互作模型的基础上对活性化合物4c的进一步优化也正7 采用荧光法检测各目标化合物体外对 GSK-3β 的抑制活性。使用 Invitrogen 公司的 Z-LYTETM测试试剂盒，GSK-3β 采用从大肠杆菌中表达并纯化的全长人源重组蛋白，阳性对 照物为 staurosporine。 实验方法 (1). 配制 1.33×的 GSK-3β缓冲液。用水稀释 5×的酶缓冲液至 1.33×。 (2). 配制 4×的待测化合物溶液。用 4％DMSO 水溶液配制待测化合物溶液浓度为最终 实验所需浓度的 4 倍。 (3). 配制酶/肽混合物。用 1.33×的酶缓冲液稀释使酶浓度为实验测得最佳浓度的 2 倍浓度，Z’-LYTETM Ser/Thr 9 肽浓度为 4μM.。 (4). 将 2μL Z’-LYTETM Ser/Thr 9 磷酸化肽加到 498μL 1.33×的酶缓冲液，混合 均匀。 (5). 用 1.33×的酶缓冲液将 10mM ATP 稀释至实验浓度的 4 倍。 (6). 按照说明书的流程，正确加入各种试剂，最后加入 ATP，得 10μL 的反应体系， 室温孵化 1 小时。 (7). 各孔中分别加入 5μL Development 溶液，得 15μL 的反应体系，室温孵化 1 小 时。 (8). 各孔中加入 5μL 终止液，然后检测荧光。 3. 结果与讨论 本工作以 GSK-3β晶体结构中的非 ATP 结合区为作用位点，选取 TDZD 与此位点作用最 密切的三个氨基酸 Arg96，Lys205 和 Tyr216 构建筛选靶点，通过对结构多样性的类药性小 分子库 Maybridge 进行虚拟筛选，发现 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物 （1）可能是潜在的非 ATP 竞争抑制剂。通过对打分结果和候选化合物结构的分析，设计并 合成了 8 个此类化合物的衍生物。主要考察母环 2 位氢被不同芳杂环取代的影响和 5 位氮原 子被不同取代基取代的活性变化。芳杂环选择了呋喃环和噻吩环，氮取代基选择了支链短烃 异丙基和具有一定体积和电性的苄基。合成的目标化合物结构均经核磁共振氢谱和质谱确 证。 采用荧光法检测 8 个目标化合物的体外 GSK-3β抑制活性，其中化合物（4c）对 GSK-3 β具有微摩尔级的抑制作用，其 IC50 为 47.69±2.38 µM。测试结果亦表明，此类化合物 5 位氮氢如被烷基，如甲基或异丙基取代（4a, 4b，4d，4e）均未显示出活性，而被苄基取 代（4c）则活性较好。由 Fig.2B 可以看出， 5 位 N 原子在活性腔中与 Phe67 邻近，在此位 置引入苄基，能有效地与受体蛋白间π-π堆积（stacking）相互作用，从而提高该抑制剂 的酶抑制活性。这与我们最初虚拟筛选时所进行的简单构效关系（SAR）分析结果一致，也 验证了我们虚拟筛选模型的合理性。而 2 位氢被噻吩环取代未显示出活性（4d-4f），呋喃 环取代则显示出有活性（4c）。在此互作模型的基础上对活性化合物 4c 的进一步优化也正 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn