复旦大学：《药物设计学》课程教学资源（教学研究）基于靶点结构的药物设计_新型苯并硫氮杂卓酮类非ATP 竞争GSK-3β抑制剂的设计、合成和活性评价

山国凌论又在线 http://www.paper.edu.cn 新型苯并硫氮杂草酮类非ATP竞争GSK-3β抑制剂的 设计、合成和活性评价 黄朝辉",胡海荣3,雷贾毅',楚勇",叶德泳 1:复旦大学药学院药化教研室,上海(200032) 复旦大学生命科学学院,上海(200433) ail:cy110@fudan.edu.cn;dyye(@shmueducn 摘要:本研究针对GSK-3β的非ATP结合的底物作用位点为作用靶点,采用 Autodock 程序对类药性小分子库 Maybridge进行虛拟筛选寻找新型GSK-3β抑制剂。虛筛结果表明 2,3-二氢苯并[b][1,4硫氮杂草-4(5-酮类化合物可能是潜在的非ATP竞争抑制剂。采用 克脑文格尔反应,环合及烷基化反应制备了8个该类化合物衍生物。体外酶抑制活性测 试结果显示,化合物2-(2-呋喃基)-5-苄基-2,3-二氢苯并[b]I,4]硫氮杂草-4(5-酮(4c) 对GSK-3β具有中等抑制活性(ICs47.69±2.38μM。活性化合物(4c)的结构与目前报道 的其它GSK-3β抑制剂不同,可望作为多种疾病治疗的新的先导化合物,值得进一步研究 关健词:糖原合成酶激酶3β(GSK-3β),虛拟筛选,酶抑制剂,合成 1.引言 糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,能磷酸化糖原合成酶 使其失活2。研究表明,GSK-3B参与了多种信号通路的调控,与I型糖尿病3、阿尔茨海 默病、肿瘤°等多种疾病的发生发展有密切联系。当前,基于GSK-3激酶信号通路开发GSK-3 β的小分子抑制剂用于治疗复杂性疾病,如癌症、糖尿病和早老年性痴呆症等已成为一个新 的研究热点。 GK-3β有两个重要的活性结合位点。其一为ATP结合位点。由于该位点在所有蛋白激 酶中高度保守,从而导致此类抑制剂大都选择性较差,可能的副作用较多,极大地限制了其 最终成药的可能性。目前已有的GSK-3β抑制剂绝大多数均为ATP竞争型,只有少数几个显 示出了较好的选择性。其二为GSK-3β特有且高度保守的非ATP结合的底物作用位点。该位 点是由Ag96,Arg180,Lys205和Tyr216组成的正电性口袋,作用于该结合位点的抑制剂 有望实现高选择性6。2002年报道的噻二唑酮类化合物(TDZD)是首个作用于此底物结合 区的非ATP竞争抑制剂,的确显示出了较高的选择性8 提高选择性是GSK-3β抑制剂研究的关键所在,因而非ATP竞争型抑制剂的发现具有更 实际的意义。然而遗憾的是,传统的高通量筛选方法对于寻找此类抑制剂并不十分有效。相 较而言,针对GSK-3β的非ATP结合区的三维晶体结构进行虚拟筛选和药物设计却有可能获 本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金资助(No.20070246089) #二者对本文的贡献相同,为并列第一作者:*通讯作者

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金资助(No. 20070246089)。 # 二者对本文的贡献相同，为并列第一作者； * 通讯作者 1 新型苯并硫氮杂 酮类非 ATP 竞争 GSK-3β抑制剂的 设计、合成和活性评价 黄朝辉 1#， 胡海荣 2#， 雷贾毅 1 ， 楚勇 1*， 叶德泳 1* 1：复旦大学药学院药化教研室，上海(200032) 2：复旦大学生命科学学院，上海(200433) E-mail: cy110@fudan.edu.cn; dyye@shmu.edu.cn 摘要：本研究针对 GSK-3β的非 ATP 结合的底物作用位点为作用靶点，采用 Autodock 程序对类药性小分子库 Maybridge 进行虚拟筛选寻找新型 GSK-3β抑制剂。虚筛结果表明 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物可能是潜在的非 ATP 竞争抑制剂。采用 克脑文格尔反应，环合及 N-烷基化反应制备了 8 个该类化合物衍生物。体外酶抑制活性测 试结果显示，化合物 2-(2-呋喃基)-5-苄基-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮（4c） 对 GSK-3β具有中等抑制活性 (IC50 47.69±2.38µM)。活性化合物（4c）的结构与目前报道 的其它 GSK-3β抑制剂不同，可望作为多种疾病治疗的新的先导化合物，值得进一步研究。 关键词：糖原合成酶激酶 3β(GSK-3β)，虚拟筛选，酶抑制剂，合成 1. 引言 糖原合成酶激酶－3β(GSK-3β)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能磷酸化糖原合成酶 使其失活 1, 2。研究表明，GSK-3β参与了多种信号通路的调控，与 II 型糖尿病 3 、阿尔茨海 默病 4 、肿瘤 5 等多种疾病的发生发展有密切联系。当前，基于 GSK-3 激酶信号通路开发 GSK-3 β的小分子抑制剂用于治疗复杂性疾病，如癌症、糖尿病和早老年性痴呆症等已成为一个新 的研究热点。 GSK-3β有两个重要的活性结合位点。其一为 ATP 结合位点。由于该位点在所有蛋白激 酶中高度保守，从而导致此类抑制剂大都选择性较差，可能的副作用较多，极大地限制了其 最终成药的可能性。目前已有的 GSK-3β抑制剂绝大多数均为 ATP 竞争型，只有少数几个显 示出了较好的选择性。其二为 GSK-3β特有且高度保守的非 ATP 结合的底物作用位点。该位 点是由 Arg96，Arg180，Lys205 和 Tyr216 组成的正电性口袋，作用于该结合位点的抑制剂 有望实现高选择性 6, 7。2002 年报道的噻二唑酮类化合物（TDZD）是首个作用于此底物结合 区的非 ATP 竞争抑制剂，的确显示出了较高的选择性 8 。 提高选择性是 GSK-3β抑制剂研究的关键所在，因而非 ATP 竞争型抑制剂的发现具有更 实际的意义。然而遗憾的是，传统的高通量筛选方法对于寻找此类抑制剂并不十分有效。相 较而言，针对 GSK-3β的非 ATP 结合区的三维晶体结构进行虚拟筛选和药物设计却有可能获 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山图我蔹记义在线 /www.pa 得新的具有更高选择性的非ATP竞争型抑制剂。与高通量筛选相比,虚拟筛选不存在样品的 限制,经过虚筛以后再进行生物学测试,“命中率”也远远高于随机的高通量筛选“0 因此,本工作首先建立了针对GSK-3B激酶晶体结构 PDB code:1UV5)特定靶点的虚拟 筛选模型。以其特有的非ATP结合的底物作用区作为作用位点,选取非ATP竞争型抑制剂 TDZD与此位点作用最密切的三个氨基酸Arg96,Lys205和Tyr216构建基于靶点的筛选模型; 采用 Autodock3.0.5程序对 Mobridge数据库中5万个分子分成15个结点分别进行对接, 每一化合物产生20个构象;根据结合自由能及簇分析结果,初步筛选出一定数量的命中化 合物。结果发现其中打分较高的前20个命中化合物中有4个具有相同的分子骨架结构,均 属于2,3-二氢苯并[b][,4硫氮杂草-4(⑤-酮类化合物(图1),其结构与现有GSK-3B抑 制剂有较大区别,可能是一类潜在的新型结构GSK-3B抑制剂。 R2 R scoring order 4-methylthiophen-3-yl thiophen- 3-methylthiophen-2-yl 2346 图1虚拟筛选命中的苯并硫氮杂草酮类化合物 Fig. l. Hits of dihydrobenzo thiazepineones by virtual screening 这4个命中化合物中,硫氮杂草环的2位氢均被噻吩杂环以其a位或β位取代。而且 打分居于第2、3、4位的分子中的硫氮杂草环的氮原子均有甲基取代(化合物1a,1b,1c)。 值得注意的是,如果该氮原子无取代基(1d,则其打分排名落到第16位。因此,该氮原子 是否有取代基可能对活性或选择性有较大影响。由于所有虚筛命中化合物的氮取代基均为甲 基,因此,其它取代基对活性或选择性的影响还有待进一步验证。但从对接模型上看,5位 氮原子周围有较大的疏水性空间,引入较大的疏水性基团,如苯环可能更有利于获得高活性。 基于以上考虑,除了需合成虚拟筛选得到的以上命中化合物进行实际的活性验证外,还 有必要设计和合成更多的N-取代衍生物,以考察不同的取代基对活性可能产生的影响。因 此,选择了甲基,支链短烃异丙基和具有一定体积和电性的苄基作为4位氮的取代基。同时, 基于电子等排原理,我们还设计了一系列以呋喃环替代噻吩环的类似物,以考察不同芳杂环 在母环2位取代的影响 目标化合物的合成如图2所示。呋喃甲醛或噻吩甲醛与丙二酸在碱催化下,发生克脑文 格尔反应生成烯酸;然后与邻氨基苯硫酚在高温下缩合脱水并进一步进行环加成反应,生 成2,3-二氢苯并[b][1,4硫氮杂草-4(51-酮:再在NaH作用下与相应卤代烃进行烷基 化反应即生成相应的目标化合物1。最终合成了8个氮取代的2,3-二氢苯并[b[1,4]硫氮杂 草-4(5-酮类衍生物

2 得新的具有更高选择性的非 ATP 竞争型抑制剂。与高通量筛选相比，虚拟筛选不存在样品的 限制，经过虚筛以后再进行生物学测试，“命中率”也远远高于随机的高通量筛选 9, 10 。 因此，本工作首先建立了针对 GSK-3β激酶晶体结构(PDB code:1UV5)特定靶点的虚拟 筛选模型。以其特有的非 ATP 结合的底物作用区作为作用位点，选取非 ATP 竞争型抑制剂 TDZD 与此位点作用最密切的三个氨基酸 Arg96，Lys205 和 Tyr216 构建基于靶点的筛选模型； 采用 Autodock 3.0.5 程序对 Mybridge 数据库中 5 万个分子分成 15 个结点分别进行对接， 每一化合物产生 20 个构象；根据结合自由能及簇分析结果，初步筛选出一定数量的命中化 合物。结果发现其中打分较高的前 20 个命中化合物中有 4 个具有相同的分子骨架结构，均 属于 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物（图 1），其结构与现有 GSK-3β抑 制剂有较大区别，可能是一类潜在的新型结构 GSK-3β抑制剂。 N S O 1 2 3 5 4 R1 R2 1a 1b 1c 1d R1 R2 scoring order CH3 4-methylthiophen-3-yl CH3 CH3 H thiophen-3-yl 3-methylthiophen-2-yl 2 3 4 thiophen-3-yl 16 1 图 1 虚拟筛选命中的苯并硫氮杂 酮类化合物 Fig.1.Hits of dihydrobenzo thiazepineones by virtual screening 这 4 个命中化合物中，硫氮杂 环的 2 位氢均被噻吩杂环以其α位或β位取代。而且 打分居于第 2、3、4 位的分子中的硫氮杂 环的氮原子均有甲基取代（化合物 1a，1b，1c）。 值得注意的是，如果该氮原子无取代基(1d)，则其打分排名落到第 16 位。因此，该氮原子 是否有取代基可能对活性或选择性有较大影响。由于所有虚筛命中化合物的氮取代基均为甲 基，因此，其它取代基对活性或选择性的影响还有待进一步验证。但从对接模型上看，5 位 氮原子周围有较大的疏水性空间，引入较大的疏水性基团，如苯环可能更有利于获得高活性。 基于以上考虑，除了需合成虚拟筛选得到的以上命中化合物进行实际的活性验证外，还 有必要设计和合成更多的 N－取代衍生物，以考察不同的取代基对活性可能产生的影响。因 此，选择了甲基，支链短烃异丙基和具有一定体积和电性的苄基作为 4 位氮的取代基。同时， 基于电子等排原理，我们还设计了一系列以呋喃环替代噻吩环的类似物，以考察不同芳杂环 在母环 2 位取代的影响。 目标化合物的合成如图 2 所示。呋喃甲醛或噻吩甲醛与丙二酸在碱催化下，发生克脑文 格尔反应生成烯酸 11；然后与邻氨基苯硫酚在高温下缩合脱水并进一步进行环加成反应，生 成 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮 12 ；再在 NaH 作用下与相应卤代烃进行 N-烷基 化反应即生成相应的目标化合物 13 。最终合成了 8 个氮取代的 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类衍生物。 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国技论文在线 http://www.paper.edu.cn H COOH -CH=CHCOOH 2 NaH/DMF 4d s methyl o methyl 4b 0 ISopropanol 图2.目标化合物合成 采用荧光法检测各目标化合物体外对GSK-3β的抑制活性。由于荧光信号的强度与剩余 ATP的量成正比,与激酶的活性成反比,与化合物抑制酶活性的强度呈正比,因而可通过检 测溶液中剩余ATP的量,从而检测化合物对激酶的活性。测试结果表明其中化合物(4c)体 外对GSK-3β有中等强度的抑制活性,其IC值为47.69±2.38剛M。 采用与虚筛相同的激酶晶体结构,进一步通过分子对接计算,对比考察4c及非ATP竞 争抑制剂TDZD8与GSK-3B激酶的结合模式(图3),以指导新的分子设计。 ALA204 Ys206 A.活性分子4和TDZ8与GSK-3β激酶的结B.活性分子4c与GSK-3β激酶对接活性腔结构。即以4c 合模式。其中绿色棒状小分子是作为ATP竞争性为中心的周围6A范围内的氨基酸残基 抑制剂共结晶的配体BI0:按原子类型显色的 球棍模型分子为本研究中的4c:蓝色棒状小分子 是文献报道的非ATP竞争性抑制剂TDZD8 图3活性分子与GSK-3β激酶的结合模式 Fig. 3. Docking model of inhibitors to GSK-3B

3 CHO + COOH COOH py, piperidine heat CH=CHCOOH 2 SH NH2 heat NaH/DMF RX X=Br or Cl 4 X X N H S O X 3 N S O X R 3a 3b 4a 4b 4c 4d 4e 4f X O S O O R methyl isopropanyl X O S S S R benzyl methyl isopropanyl benzyl 图 2. 目标化合物合成 Fig. 2. Synthesis of target compounds 采用荧光法检测各目标化合物体外对 GSK-3β 的抑制活性。由于荧光信号的强度与剩余 ATP 的量成正比，与激酶的活性成反比，与化合物抑制酶活性的强度呈正比，因而可通过检 测溶液中剩余 ATP 的量，从而检测化合物对激酶的活性。测试结果表明其中化合物（4c）体 外对 GSK-3β有中等强度的抑制活性，其 IC50值为 47.69±2.38 µM。 采用与虚筛相同的激酶晶体结构，进一步通过分子对接计算，对比考察 4c 及非 ATP 竞 争抑制剂 TDZD 8 与 GSK-3β激酶的结合模式(图 3)，以指导新的分子设计。 A.活性分子 4c 和 TDZD 8 与 GSK-3β激酶的结 合模式。其中绿色棒状小分子是作为 ATP 竞争性 抑制剂共结晶的配体 BIO14； 按原子类型显色的 球棍模型分子为本研究中的 4c；蓝色棒状小分子 是文献报道的非 ATP 竞争性抑制剂 TDZD 8。 B.活性分子 4c 与 GSK-3β激酶对接活性腔结构。即以 4c 为中心的周围 6Å 范围内的氨基酸残基 图 3 活性分子与 GSK-3β激酶的结合模式 Fig. 3. Docking model of inhibitors to GSK-3β N S N O O TDZD 8 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国技论义在线 http://www.pape 根据 Martinez等人的推测,非ATP竞争性GSK-3β激酶抑制剂TDZD类衍生物的结合位 点由Arg96,Arg180, and lys205三个碱性残基构成。我们在以此三个残基的质心作为 活性中心进行虚拟筛选的基础上,对8个氮取代的2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5 酮类衍生物进行了对接分析,结果表明化合物4c的确能结合到GSK-3β激酶的非ATP竞争 性抑制剂TDZD8的相应结合部位(图3A)。但我们的计算结果所预测的活性腔主要由Phe67 Phe93,Arg96,Lys205构成(图3B),与该文献推测的结果不完全一致。我们的分子对接计 算还显示TDZD8的理论预测的抑制活性约23.6叫,理论结合自由能约为-6.31kcal.mol1 其结合模式也与本研究中的4c高度相似,几乎重叠(图3A)。 需要说明的是,在我们的计算过程中,充分考虑了GSK-3β激酶这一区域的特点,选取 的格点数足够多,且增加采集对接构象的样本量(从20增加到50),足以保证配体小分子 在活性腔中的自由的对接,从而获得对接自由能及簇分析匹配最佳的优势构象。理论预测化 合物4c的抑制活性约1.86剛M,理论结合自由能约为-7.82kcal.mo 在此工作中,通过虚拟筛选,不仅发现了一类新型的GSK-3B活性化合物,而且仅合 成8个目标物即从中发现一个活性物,命中率也较高。该结果亦表明我们先期建立的虚拟筛 选模型具有一定的准确性和合理性。并进一步详细分析了4c及其衍生物与GSK-3β激酶的 结合模式,基于此模型进行进一步优化改造可望发现更多更好的候选化合物。 2.实验部分 2.1虚拟筛选 受体分子准备:首先选取了GSK-3β晶体结构(PDB号1UV5)的非ATP结合区中与文献 报道的非ATP竞争抑制剂TDZD作用最密切的三个氨基酸Arg96,Lys205和Tyr216的质心构 建筛选靶点。先采用 Swiss pdbⅤ lewer检查蛋白缺失的残基,再在 Autodock tools中删去 水分子和配体小分子,为受体大分子添加极性氢并加载 KOLLMAN电荷。所得结构用 AutoDock Tools转换成 pubs文件,设定网格大小和网格参数,用 Autogrid模块计算每个网格点与 探针原子的作用能。 配体分子:采用 Autodock Tools对 Mobridge数据库中的5万个分子预先都去掉所有 氢原子,只加极性氢,计算 Gasteiger- Huckel电荷,存为pdbq文件。 对接时将 Mobridge数据库中的5万个分子分成15个结点分别进行对接研究,每一化合 物产生20个构象,根据结合自由能及簇分析结果,筛选出一定数量的候选化合物,计算采 用 Autodock3.0.5分子对接软件 对接采用 Lamarckian遗传算法,并用 Solis and wets局部搜寻算法进行能量优化。修 改 Lamarckian算法3个参数 maximum number of energy evalutions, maximum number of generations和 docking runs分别为1500000370000和20 以上所用参数除特别指明外均采用默认参数

4 根据 Martinez 等人的推测，非 ATP 竞争性 GSK-3β激酶抑制剂 TDZD 类衍生物的结合位 点由 Arg 96, Arg 180, and Lys 205 三个碱性残基构成 8 。我们在以此三个残基的质心作为 活性中心进行虚拟筛选的基础上， 对 8个氮取代的 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)- 酮类衍生物进行了对接分析，结果表明化合物 4c 的确能结合到 GSK-3β激酶的非 ATP 竞争 性抑制剂 TDZD 8 的相应结合部位(图 3A)。但我们的计算结果所预测的活性腔主要由 Phe67， Phe93，Arg 96，Lys205 构成(图 3B)，与该文献推测的结果不完全一致。我们的分子对接计 算还显示 TDZD 8 的理论预测的抑制活性约 23.6 µM，理论结合自由能约为-6.31 kcal. mol-1， 其结合模式也与本研究中的 4c 高度相似，几乎重叠（图 3A）。 需要说明的是，在我们的计算过程中，充分考虑了 GSK-3β激酶这一区域的特点，选取 的格点数足够多，且增加采集对接构象的样本量（从 20 增加到 50），足以保证配体小分子 在活性腔中的自由的对接，从而获得对接自由能及簇分析匹配最佳的优势构象。理论预测化 合物 4c 的抑制活性约 1.86 µM，理论结合自由能约为-7.82 kcal.mol-1。 在此工作中，通过虚拟筛选，不仅发现了一类新型的 GSK-3β活性化合物，而且仅合 成 8 个目标物即从中发现一个活性物，命中率也较高。该结果亦表明我们先期建立的虚拟筛 选模型具有一定的准确性和合理性。并进一步详细分析了 4c 及其衍生物与 GSK-3β激酶的 结合模式,基于此模型进行进一步优化改造可望发现更多更好的候选化合物。 2. 实验部分 2.1 虚拟筛选 受体分子准备：首先选取了 GSK-3β晶体结构（PDB 号 1UV5）的非 ATP 结合区中与文献 报道的非 ATP 竞争抑制剂 TDZD 作用最密切的三个氨基酸 Arg96，Lys205 和 Tyr216 的质心构 建筛选靶点。先采用 Swiss PDB Viewer 检查蛋白缺失的残基，再在 Autodock Tools 中删去 水分子和配体小分子，为受体大分子添加极性氢并加载 KOLLMAN 电荷。所得结构用 AutoDock Tools 转换成 pdbqs 文件，设定网格大小和网格参数，用 AutoGrid 模块计算每个网格点与 探针原子的作用能。 配体分子：采用 Autodock Tools 对 Mybridge 数据库中的 5 万个分子预先都去掉所有 氢原子，只加极性氢，计算 Gasteiger- Hückel 电荷，存为 pdbq 文件。 对接时将 Mybridge 数据库中的 5 万个分子分成 15 个结点分别进行对接研究，每一化合 物产生 20 个构象，根据结合自由能及簇分析结果，筛选出一定数量的候选化合物， 计算采 用 Autodock 3.0.5 分子对接软件。 对接采用 Lamarckian 遗传算法,并用 Solis and Wets 局部搜寻算法进行能量优化。修 改 Lamarckian 算法 3 个参数 maximum number of energy evalutions, maximum number of generations 和 docking runs 分别为 1500000、370000 和 20。 以上所用参数除特别指明外均采用默认参数。 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山目正义在线 ://www.paper.edu.cn 22目标化合物合成及鉴定 22.1仪器与试剂 所用试剂和溶剂均为市售分析纯,如无特殊说明均未经进一步处理。核磁共振氢谱由 Mercury plus400型核磁共振仪测定:质谱由 Agilent1100LC-MS(ESI)质谱仪测定。 22.2目标化合物合成 氮取代2-(2呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮类化合物的合成 3-(2呋喃基)丙烯酸(2a) 丙二酸20.8g(0.2mol)、糠醛16.6ml(0.2mo1)、吡啶10m1(0.12mo)和哌啶10 滴加入干燥圆底烧瓶中,油浴110℃左右搅拌回流2小时。反应完毕,加水析出沉淀:收集 固体使之尽量溶解于氨水。减压抽滤,水洗,滤液合并,盐酸酸化,析出沉淀,冰浴冷却1 小时后过滤,滤渣水洗至中性,50%的乙醇/水溶液重结晶,得无色晶体(1a)18.9g(收率 69%)。HNR(400MHz,CDC1):δppm:6.32(d,1H,J=16.04Hz);6.49-6.50(d 1H,J=1.96Hz,J=3.52Hz);6.68(d,1H,J=3.13Hz);7.52(d,1H,J=15.56Hz) 87.52(d,1H,J=1.96Hz).MS(-ESD):137.1(M-m;275.0(2M-H 2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮(3a) 化合物(2a)14.7g(0.106mol)、邻氨基苯硫酚13.32g(0.106mol)、适量分子筛加入 干燥的圆底烧瓶,油浴190℃反应1.5小时。反应完毕,加入80m1乙腈,过滤。滤液冷却 静置析出固体,抽滤,滤渣用少量乙腈洗涤,得目标化合物③3a)15.6g,类白色粉末,收率 60%。HMR(400MHz,CDCl3):δpp:2.82-2.93(m,2,4.93(m,1H,6.16(d,lH, J=3.13Hz),6.30(m,1,7.15-7.59(m,5H),8.19(brs,1H)。MS(+ESD):246.1(M+ H∵;491.2(2M+H’;513.1(2M+Na)'。 5-甲基-2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(51-酮(4a) 向8m1重蒸干燥DMF中加入化合物(3a)0.49g(2mol)和60%的NaH0.6g(6mo1),室 温搅拌0.5小时后,将碘甲烷0.249ml(4mmol)溶到6ml重蒸干燥的DMF中,冰水浴冷却 下滴加到反应液中,室温密闭搅拌16小时。反应液用盐酸酸化,收集析出固体,水洗至中 性,甲醇重结晶得淡褐色晶体67mg,收率13%HNMR(400MHz,CDCl):8ppm:2.76-2.85(m, 2H,3.39(s,3H),4.85(m,1H),6.00(d,1H,J=1.84Hz),6.26(s,1),7.20-7.53(m, 5H)。MS(+ESI):260.0(M+H’;541.2(2M+Na) 5异丙基2-(2呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][,4]硫氮杂草-4(5-酮(4b) 参照化合物(4a)的制备方法。产物经硅胶柱层析(石油醚:丙酮=20:1)得淡黄色粘稠油 状物,静置过夜,凝固成淡黄色短针状晶体,收率11%。HMR(400MHz,CDCl):δppm 05(d,3H,严7.03Hz),1.45(d,3H,J=7.03Hz),2.60(m,1H,2.74(m,1H),4.81(m, 1H),4.90(m,1H,5.92(d,1H,J=3.05Hz),6.24(dd,1H,J=1.83Hz,J=3.05Hz)

5 2.2 目标化合物合成及鉴定 2.2.1 仪器与试剂 所用试剂和溶剂均为市售分析纯，如无特殊说明均未经进一步处理。核磁共振氢谱由 Mercury Plus 400 型核磁共振仪测定；质谱由 Agilent 1100 LC-MS (ESI)质谱仪测定。 2.2.2 目标化合物合成 氮取代 2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b] [1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物的合成 3-(2-呋喃基)丙烯酸(2a) 丙二酸 20.8g（0.2 mol）、糠醛 16.6 ml（0.2 mol）、吡啶 10ml (0.12 mol)和哌啶 10 滴加入干燥圆底烧瓶中，油浴 110℃左右搅拌回流 2 小时。反应完毕，加水析出沉淀；收集 固体使之尽量溶解于氨水。减压抽滤，水洗，滤液合并，盐酸酸化，析出沉淀，冰浴冷却 1 小时后过滤，滤渣水洗至中性，50%的乙醇/水溶液重结晶，得无色晶体(1a) 18.9g (收率 69%)。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm : 6.32 (d, 1H, J =16.04 Hz); 6.49-6.50 (dd, 1H, J =1.96 Hz, J =3.52 Hz); 6.68(d, 1H, J =3.13 Hz); 7.52(d, 1H, J =15.56 Hz); δ7.52(d, 1H, J =1.96 Hz). MS(-ESI): 137.1(M-H)- ; 275.0 (2M-H)- . 2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(3a) 化合物(2a)14.7g（0.106 mol）、邻氨基苯硫酚 13.32g (0.106mol)、适量分子筛加入 干燥的圆底烧瓶，油浴 190℃反应 1.5 小时。反应完毕，加入 80ml 乙腈，过滤。滤液冷却 静置析出固体，抽滤，滤渣用少量乙腈洗涤，得目标化合物(3a)15.6g，类白色粉末，收率 60％。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm : 2.82-2.93(m, 2H)， 4.93(m, 1H)， 6.16 (d, 1H, J =3.13 Hz)， 6.30(m, 1H)， 7.15-7.59(m, 5H)，8.19(br s, 1H)。MS(+ESI): 246.1(M+ H) +; 491.2(2M+ H) +; 513.1(2M+Na) + 。 5-甲基-2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4a) 向 8ml 重蒸干燥 DMF 中加入化合物(3a)0.49g (2mmol)和 60%的 NaH 0.6g（6mmol），室 温搅拌 0.5 小时后，将碘甲烷 0.249ml（4mmol）溶到 6ml 重蒸干燥的 DMF 中，冰水浴冷却 下滴加到反应液中，室温密闭搅拌 16 小时。反应液用盐酸酸化，收集析出固体，水洗至中 性，甲醇重结晶得淡褐色晶体 67mg，收率 13%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm ：2.76-2.85(m, 2H)， 3.39(s, 3H)， 4.85(m, 1H)， 6.00(d, 1H, J =1.84 Hz)， 6.26(s, 1H)，7.20-7.53(m, 5H)。 MS(+ESI): 260.0(M+H) +; 541.2(2M+ Na) + 。 5-异丙基-2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4b) 参照化合物(4a)的制备方法。产物经硅胶柱层析（石油醚:丙酮=20:1）得淡黄色粘稠油 状物，静置过夜，凝固成淡黄色短针状晶体，收率 11%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm: 1.05(d, 3H, J=7.03 Hz)，1.45(d, 3H, J =7.03 Hz)，2.60(m, 1H)，2.74(m, 1H)，4.81(m, 1H)，4.90(m, 1H)，5.92(d, 1H, J =3.05 Hz)，6.24 (dd, 1H, J =1.83 Hz,J =3.05 Hz)， 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国技论义在线 http://www.paper.edu.cn 7.24-7.53(m,5H。MS(+ESI):288.1(M+H',575.2(2M+H’。 5-苄基-2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮(4c) 参照化合物(4a)的制备方法。室温密闭搅拌1小时。反应液用盐酸酸化,收集析出的固 体,水洗至中性,甲醇重结晶得纯品(4e),收率42%。HNR(400MHz,CDCl3):8ppm: 2.81-2.92(m,2H,4.89(m,1H),5.01(d,1H,J=15.26Hz),5.17(d,1H,J=15.26 Hz),5.99(d,1H,J=2.35Hz),6.26(s,1H,7.14-7.47(m,10H)MS(+ESI):336.1(M+H。 氮取代2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮类化合物的合成 3-(2-噻吩基)丙烯酸(2b) 参照化合物(2a)的制备。收率70%。HMMR(400Mz,CDC1):δpm:6.24(d,lH, =15.65Hz),7.08(m,1H,7.30(d,1H,J=3.91Hz),7.43(d,1H,J=5.09Hz),7.88(d, 1H,J=15.65Hz)。MS(ESI):153.1(M-H)。 2-(2噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮(3b) 参照化合物(38)的制备。类白色粉末,收率66%。HNMR(400MHz,CDC13):8ppm 2.81-2.97(m,2H,5.16(m,1H;6.91-6.94(m,1H;6.96(d,1H),7.14-7.67(m,5H), 7.62(s,1H。MS(+ESI):262.00M+H;523.0(2M+H 5-甲基2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][,4]硫氮杂草-4(5-剩(4d) 参照化合物(4a)的制备。收率60%。HNMR(400MHz,CDCl3):8ppm:2.72-2.78(t,1H 2.93(m,1H),3.40(s,1H,5.10(m,1H,6.84(s,1),6.90(s,1H),7.16-7.65(m,5H) MS(+ESD):276.0(M+H'。 5-异丙基-2-(2噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(5-酮(4e) 参照化合物(4a)的制备。经硅胶柱层析(石油醚:丙酮=20:1)得淡黄色粘稠油状物,静 置凝固成淡黄色针状晶体,收率50%。HNMR(400MHz,CDC13):δpm:1.05(d,3H),1.45(d, 3H),2.57-2.63(t,1H,2.86(m,1H,4.90(m,1H,5.06(d,1H,J=5.48Hz,J=12.52 ),6.79(d,1H,J=3.13Hz),6.88(dd,1H,J=3.52Hz,J=5.09Hz),7.14-7.64(m, 5H)。Ms(+ESI):304.1M+H,326.0(M+Na)’,607.2(2M+H’,629.0(2M+Na)'。 5苄基2-(2噻吩基)-2,3二氢苯并[b][1,4]硫氮杂草-4(51-酮(4) 参照化合物(4a)的制备。收率26%。HNMR(400MHz,CDC13):δppm:2.79-2.85(m,1H, 3.00(m,1H,5.12-5.17(m,1H,4.99-5.21(m,2H),5.99(d,1H,J=3.52Hz),6.88-6.90 (m,1H,7.15-7.58(m,10H。Ms(+ESI):352(M+H),703.2(2M+H。 2.3体外GSK-3β酶抑制活性测试

6 7.24-7.53(m, 5H)。MS(+ESI): 288.1(M+H)+ ，575.2(2M+H)+ 。 5-苄基-2-(2-呋喃基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4c) 参照化合物(4a)的制备方法。室温密闭搅拌 1 小时。反应液用盐酸酸化，收集析出的固 体，水洗至中性，甲醇重结晶得纯品(4c),收率 42%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm： 2.81-2.92(m, 2H)， 4.89(m, 1H)， 5.01(d, 1H, J =15.26 Hz)， 5.17(d, 1H, J =15.26 Hz)， 5.99(d, 1H, J =2.35 Hz)， 6.26(s, 1H)， 7.14-7.47(m, 10H)。MS(+ESI): 336.1(M+H)+ 。 氮取代 2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物的合成 3-(2-噻吩基)丙烯酸(2b) 参照化合物(2a)的制备。收率 70%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm ：6.24 (d, 1H, J =15.65 Hz)，7.08(m, 1H)， 7.30 (d, 1H, J =3.91 Hz)， 7.43(d, 1H,J =5.09 Hz)， 7.88(d, 1H, J =15.65 Hz)。MS(-ESI): 153.1(M-H)- 。 2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(3b) 参照化合物(3a)的制备。类白色粉末，收率 66％。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm ： 2.81-2.97(m, 2H),5.16(m,1H); 6.91-6.94(m, 1H); 6.96(d, 1H)， 7.14-7.67(m, 5H)， 7.62(s, 1H)。MS(+ESI): 262.0(M+H); 523.0(2M+H)+ 。 5-甲基-2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4d) 参照化合物(4a)的制备。收率 60%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm ：2.72-2.78(t,1H);， 2.93(m,1H)，3.40 (s, 1H)，5.10(m,1H)，6.84(s, 1H)， 6.90(s, 1H)， 7.16-7.65(m, 5H)。 MS(+ESI): 276.0(M+H) + 。 5-异丙基-2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4e) 参照化合物(4a)的制备。经硅胶柱层析（石油醚:丙酮=20:1）得淡黄色粘稠油状物，静 置凝固成淡黄色针状晶体，收率 50%。1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm ：1.05(d, 3H)， 1.45(d, 3H)， 2.57-2.63(t, 1H)， 2.86(m, 1H)，4.90(m, 1H)，5.06(dd, 1H,J =5.48 Hz,J =12.52 Hz)， 6.79(d, 1H,J =3.13 Hz)， 6.88(dd, 1H, J =3.52 Hz, J =5.09 Hz)， 7.14-7.64(m, 5H)。MS(+ESI): 304.1(M+H) +, 326.0(M+Na) +，607.2(2M+H) +， 629.0(2M+Na) + 。 5-苄基-2-(2-噻吩基)-2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮(4f) 参照化合物(4a)的制备。收率 26%。 1 H NMR (400MHz, CDCl3): δ ppm：2.79-2.85(m,1H)， 3.00(m, 1H)，5.12-5.17(m, 1H)， 4.99-5.21(m, 2H,)， 5.99(d, 1H, J =3.52 Hz)， 6.88-6.90 (m, 1H)，7.15-7.58(m, 10H)。MS(+ESI): 352(M+H) +，703.2(2M+H) + 。 2.3 体外 GSK-3β酶抑制活性测试 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国武论义在统 http://www.paper.edu.cn 采用荧光法检测各目标化合物体外对GSK-3β的抑制活性。使用 Invitrogen公司的 Z-LYTE测试试剂盒,GSK-3β采用从大肠杆菌中表达并纯化的全长人源重组蛋白,阳性对 照物为 staurosporine。 实验方法 (1).配制1.33×的GSK-3β缓冲液。用水稀释5×的酶缓冲液至1.33× (2).配制4×的待测化合物溶液。用4%DM0水溶液配制待测化合物溶液浓度为最终 实验所需浓度的4倍。 (3).配制酶/肽混合物。用1.3×的酶缓冲液稀释使酶浓度为实验测得最佳浓度的 倍浓度,Z’- LYTETM Se/Thr9肽浓度为4uM.。 (4).将2μLZ- LYTETM Ser/Thr9磷酸化肽加到498μL1.33×的酶缓冲液,混合 均匀。 (5).用1.33×的酶缓冲液将10 mM ATP稀释至实验浓度的4倍 (6).按照说明书的流程,正确加入各种试剂,最后加入ATP,得10μL的反应体系, 室温孵化1小时。 (7).各孔中分别加入5μ L Deve lopment溶液,得15μL的反应体系,室温孵化1小 (8).各孔中加入5μL终止液,然后检测荧光。 3.结果与讨论 本工作以GSK-3β晶体结构中的非ATP结合区为作用位点,选取TDZD与此位点作用最 密切的三个氨基酸Arg96,Lys205和Tyr216构建筛选靶点,通过对结构多样性的类药性小 分子库 Maybridge进行虚拟筛选,发现2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂-4(5-酮类化合物 (1)可能是潜在的非ATP竞争抑制剂。通过对打分结果和候选化合物结构的分析,设计并 合成了8个此类化合物的衍生物。主要考察母环2位氢被不同芳杂环取代的影响和5位氮原 子被不同取代基取代的活性变化。芳杂环选择了呋喃环和噻吩环,氮取代基选择了支链短烃 异丙基和具有一定体积和电性的苄基。合成的目标化合物结构均经核磁共振氢谱和质谱确 采用荧光法检测8个目标化合物的体外GSK-3β抑制活性,其中化合物(4c)对GSK-3 β具有微摩尔级的抑制作用,其ICo为47.69±2.38μ。测试结果亦表明,此类化合物 位氮氢如被烷基,如甲基或异丙基取代(4a,4b,4d,4e)均未显示出活性,而被苄基取 代(4c)则活性较好。由Fig.2B可以看出,5位N原子在活性腔中与Phe67邻近,在此位 置引入苄基,能有效地与受体蛋白间π-π堆积( stacking)相互作用,从而提高该抑制剂 的酶抑制活性。这与我们最初虚拟筛选时所进行的简单构效关系(SAR)分析结果一致,也 验证了我们虚拟筛选模型的合理性。而2位氢被噻吩环取代未显示岀活性(4d-4f),呋喃 环取代则显示出有活性(4c)。在此互作模型的基础上对活性化合物4c的进一步优化也正

7 采用荧光法检测各目标化合物体外对 GSK-3β 的抑制活性。使用 Invitrogen 公司的 Z-LYTETM测试试剂盒，GSK-3β 采用从大肠杆菌中表达并纯化的全长人源重组蛋白，阳性对 照物为 staurosporine。 实验方法 (1). 配制 1.33×的 GSK-3β缓冲液。用水稀释 5×的酶缓冲液至 1.33×。 (2). 配制 4×的待测化合物溶液。用 4％DMSO 水溶液配制待测化合物溶液浓度为最终 实验所需浓度的 4 倍。 (3). 配制酶/肽混合物。用 1.33×的酶缓冲液稀释使酶浓度为实验测得最佳浓度的 2 倍浓度，Z’-LYTETM Ser/Thr 9 肽浓度为 4μM.。 (4). 将 2μL Z’-LYTETM Ser/Thr 9 磷酸化肽加到 498μL 1.33×的酶缓冲液，混合 均匀。 (5). 用 1.33×的酶缓冲液将 10mM ATP 稀释至实验浓度的 4 倍。 (6). 按照说明书的流程，正确加入各种试剂，最后加入 ATP，得 10μL 的反应体系， 室温孵化 1 小时。 (7). 各孔中分别加入 5μL Development 溶液，得 15μL 的反应体系，室温孵化 1 小 时。 (8). 各孔中加入 5μL 终止液，然后检测荧光。 3. 结果与讨论 本工作以 GSK-3β晶体结构中的非 ATP 结合区为作用位点，选取 TDZD 与此位点作用最 密切的三个氨基酸 Arg96，Lys205 和 Tyr216 构建筛选靶点，通过对结构多样性的类药性小 分子库 Maybridge 进行虚拟筛选，发现 2,3-二氢苯并[b][1,4]硫氮杂 -4(5H)-酮类化合物 （1）可能是潜在的非 ATP 竞争抑制剂。通过对打分结果和候选化合物结构的分析，设计并 合成了 8 个此类化合物的衍生物。主要考察母环 2 位氢被不同芳杂环取代的影响和 5 位氮原 子被不同取代基取代的活性变化。芳杂环选择了呋喃环和噻吩环，氮取代基选择了支链短烃 异丙基和具有一定体积和电性的苄基。合成的目标化合物结构均经核磁共振氢谱和质谱确 证。 采用荧光法检测 8 个目标化合物的体外 GSK-3β抑制活性，其中化合物（4c）对 GSK-3 β具有微摩尔级的抑制作用，其 IC50 为 47.69±2.38 µM。测试结果亦表明，此类化合物 5 位氮氢如被烷基，如甲基或异丙基取代（4a, 4b，4d，4e）均未显示出活性，而被苄基取 代（4c）则活性较好。由 Fig.2B 可以看出， 5 位 N 原子在活性腔中与 Phe67 邻近，在此位 置引入苄基，能有效地与受体蛋白间π-π堆积（stacking）相互作用，从而提高该抑制剂 的酶抑制活性。这与我们最初虚拟筛选时所进行的简单构效关系（SAR）分析结果一致，也 验证了我们虚拟筛选模型的合理性。而 2 位氢被噻吩环取代未显示出活性（4d-4f），呋喃 环取代则显示出有活性（4c）。在此互作模型的基础上对活性化合物 4c 的进一步优化也正 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国武论义在线 http://www 在进行。我们设想从两方面对此轮筛选所得活性最高的化合物4c进行进一步的结构改造 是改变5位N一苄基苯环上的取代基,进一步考察该位置芳环取代基大小和电性对活性的 影响;二是以其它的芳杂环或芳环取代2位呋喃环以寻找更佳的取代基。期望通过这样的结 构修饰获得GSK-3β激酶抑制活性更高的抑制剂。 此类活性化合物的结构与在研的GSK-3β抑制剂有明显区别,也不同于已有的糖尿病治 疗药物。以此作为先导化合物进行进一步的改造和优化,可能发现具有更高活性和选择性的 新型非ATP竞争GSK-3β抑制剂,从而为进一步研制相关的原创新型药物,如抗糖尿病药物, AD治疗药物等奠定基础。 致谢: 感谢教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金(No.20070246089),复旦大 学青年科学基金及复旦大学药学院青年基金的支持。合成目标物体外GSK-3β抑制活性的测 试由国家新药筛选中心完成,在此表示感谢 参考文献 [1] Embi, N; Rylatt, D. B: Cohen, P, Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle ration from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase [J]. Eur Biochem 1980,107,(2),519-27. [2] Woodgett, J. R: Cohen, P, Multisite phosphorylation of glycogen synthase. Molecular basis for the substrate specificity of glycogen synthase kinase-3 and casein kinase-li (glycogen synthase kinase-5)[J]. Biochim Biophys Acta 1984, 788,(3),339-47 [3] Eldar-Finkelman, H, Glycogen synthase kinase 3: an emerging therapeutic target[j].Trends lo/ ed2002,8,(3),126-32. [4] Balaraman, Y: Limaye, A. R: Levey, A. I: et al, Glycogen synthase kinase 3beta and Alzheimers disease: pathophysiological and therapeutic significance[J]. Ce11 Mo1 Life Sci 2006 63,(11),1226-35 [5] Takahashi-Yanaga, F: Sasaguri, T, Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta-mediated signal transduction pathway: inhibitors of the Wnt/beta-catenin signaling pathway as novel anticancer drugs [j]./ Pharmacol Sci 2009, 109,(2) 179-83. [6] Da jani, R: Fraser, E: Roe, S. M:et al, Crystal struct beta: structural basis for phosphate-primed substrate specificity and autoinhibition[J]. Cell 2001,105,(6),721-32

8 在进行。我们设想从两方面对此轮筛选所得活性最高的化合物 4c 进行进一步的结构改造： 一是改变 5 位 N－苄基苯环上的取代基，进一步考察该位置芳环取代基大小和电性对活性的 影响；二是以其它的芳杂环或芳环取代 2 位呋喃环以寻找更佳的取代基。期望通过这样的结 构修饰获得 GSK-3β激酶抑制活性更高的抑制剂。 此类活性化合物的结构与在研的 GSK-3β抑制剂有明显区别，也不同于已有的糖尿病治 疗药物。以此作为先导化合物进行进一步的改造和优化，可能发现具有更高活性和选择性的 新型非 ATP 竞争 GSK-3β抑制剂，从而为进一步研制相关的原创新型药物，如抗糖尿病药物， AD 治疗药物等奠定基础。 致谢： 感谢教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金(No. 20070246089)，复旦大 学青年科学基金及复旦大学药学院青年基金的支持。合成目标物体外 GSK-3β抑制活性的测 试由国家新药筛选中心完成，在此表示感谢。 参考文献 [1] Embi, N.; Rylatt, D. B.; Cohen, P., Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle. Separation from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase[J]. Eur J Biochem 1980, 107, (2), 519-27. [2] Woodgett, J. R.; Cohen, P., Multisite phosphorylation of glycogen synthase. Molecular basis for the substrate specificity of glycogen synthase kinase-3 and casein kinase-II (glycogen synthase kinase-5) [J]. Biochim Biophys Acta 1984, 788, (3), 339-47. [3] Eldar-Finkelman, H., Glycogen synthase kinase 3: an emerging therapeutic target[J]. Trends Mol Med 2002, 8, (3), 126-32. [4] Balaraman, Y.; Limaye, A. R.; Levey, A. I.; et al, Glycogen synthase kinase 3beta and Alzheimer's disease: pathophysiological and therapeutic significance[J]. Cell Mol Life Sci 2006, 63, (11), 1226-35. [5] Takahashi-Yanaga, F.; Sasaguri, T., Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway: inhibitors of the Wnt/beta-catenin signaling pathway as novel anticancer drugs[J]. J Pharmacol Sci 2009, 109, (2), 179-83. [6] Dajani, R.; Fraser, E.; Roe, S. M.;et al, Crystal structure of glycogen synthase kinase 3 beta: structural basis for phosphate-primed substrate specificity and autoinhibition[J]. Cell 2001, 105, (6), 721-32. 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国论文在线 http://www [7] ter Haar, E: Coll, J. T: Austen, D. A; et al, Structure of GSK3beta reveals a primed phosphorylation mechanism[J]. Nat Struct Biol 2001, 8,(7), 593-6. [8] Martinez, A: Alonso, M: Castro, A:et al, First non-ATP competitive glycogen synthase kinase 3 beta(GSK-3beta) inhibitors: thiadiazolidinones (TDzD)as potential drugs for the treatment of Alzheimer's disease [J]. Med Chem 2002, 45, (6),1292-9. [9] Doman, T. N: McGovern, S. L: Witherbee, B. J:et al, Molecular Docking and High-Throughput Screening for Novel Inhibitors of Protein Tyrosine Phosphatase-lBLJ. Journal of Medicina Chemistry2002,45,(11),2213-2221. [10] Polgar, T: Baki, A: Szendrei, G. I: et al, Comparative Virtual and Experimental High-Throughput Screening for Glycogen Synthase Kinase-3&#x03B2: Inhibitors[J]. Journal of Medicinal Chenistry 2005, 4 7946-7959 [11] New, J. S: Christopher, W. L: Yevich, J. P; et al, The thieno[3, 2-c]pyridine and furo[3, 2-c]pyridine rings: new pharmacophores with potential antipsychotic activity [j]. Journal of Medicinal Chemistry 1989, 32,(6), 1147-1156 [12] Lancelot, J.-C. L, Bertrand: Saturnino, Carmela; Caprariis, Paolo De: Robba, Max, A Novel Synthesis of 2, 3-Dihydro[1, 5]benzothiazepin-4(5H)-ones[J] Organic Preparations and Procedures nternational1992,24,(2),204-208 [13]A. Lvai H. Duddeck, Oxazepines and Thiazepines [j. Pharmazie 1983, 38, 827 [14] Meijer, L: Skaltsounis, A. L: Magiatis, P et al, GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins[J]. Chem Bio1. 2003, 10,(12),1255-1266

9 [7] ter Haar, E.; Coll, J. T.; Austen, D. A.; et al, Structure of GSK3beta reveals a primed phosphorylation mechanism[J]. Nat Struct Biol 2001, 8, (7), 593-6. [8] Martinez, A.; Alonso, M.; Castro, A.;et al, First non-ATP competitive glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3beta) inhibitors: thiadiazolidinones (TDZD) as potential drugs for the treatment of Alzheimer's disease[J]. J Med Chem 2002, 45, (6), 1292-9. [9] Doman, T. N.; McGovern, S. L.; Witherbee, B. J.;et al, Molecular Docking and High-Throughput Screening for Novel Inhibitors of Protein Tyrosine Phosphatase-1B[J]. Journal of Medicinal Chemistry 2002, 45, (11), 2213-2221. [10] Polgar, T.; Baki, A.; Szendrei, G. I.; et al, Comparative Virtual and Experimental High-Throughput Screening for Glycogen Synthase Kinase-3β Inhibitors[J]. Journal of Medicinal Chemistry 2005, 48, (25), 7946-7959. [11] New, J. S.; Christopher, W. L.; Yevich, J. P.; et al, The thieno[3,2-c]pyridine and furo[3,2-c]pyridine rings: new pharmacophores with potential antipsychotic activity[J]. Journal of Medicinal Chemistry 1989, 32, (6), 1147-1156. [12] Lancelot, J.-C. L., Bertrand; Saturnino, Carmela; Caprariis, Paolo De; Robba, Max, A Novel Synthesis of 2,3-Dihydro[1,5]benzothiazepin-4(5H)-ones[J].Organic Preparations and Procedures International 1992, 24, (2), 204 - 208. [13] A. Lvai ; H. Duddeck, Oxazepines and Thiazepines[J]. Pharmazie 1983, 38, 827. [14] Meijer, L.; Skaltsounis, A. L.; Magiatis, P.et al, GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins[J]. Chem. Biol. 2003, 10, (12), 1255-1266. 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn

山国破文在线 http://www.paper.edu.cn Design, synthesis and in vitro test of 2, 3-dihydrobenzo bll 4thiazepine-4(5H)-ones as novel non-ATP competitive glycogen synthase kinase-3B(GSK-3B)inhibitors Huang Zhaohui Hu Hairong2, Lei jiayi, Chu Yong *, Ye deyong* 1: School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai, China, 200032 2: School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai, China, 200433 Abstract Glycogen synthase kinase-3B(GSK-3B) is a serine/threonine kinase that has recently emerged as a key target for neurodegenerative diseases and diabetes. Most of Known ATP-binding pocket of GSK-3, which might lead widespread effects. Non-ATP-competitive GSK-3 inhibitors actually represent a more efficient pathway for providing real promising drugs for therapeutic intervention. As an initial step of our work to discover such non-ATP-competitive GSK-3 inhibitors, a virtual screening was conducted by Autodock program, which docked the small drug-like molecules of Maybridge library at the non-ATP-binding site of GSK-3B. 2, 3-Dihydrobenzo[bl[ thiazepine-4(5HH-ones(1)with variable substitutes ranked in the top of hits, likely potentially havin inhibition and highly selectivity to GSK-3B. Eight derivatives of (1)had been designed based on the virtual screening result and successfully synthesized through Knoevenagel reaction, cyclization and N-alkylation. Among them, 5-benzyl-2-(furan-2-yl)-2, 3-dihydrobenzo bl[l, 4] thiazepin-4(5H)-one(4c) showed moderate inhibition to GSK-3B in vitro(IC5o:47.69+ 2.38uM) tested by the National Center rug Screening of China. Further Docking study showed 4c can bind to the specific non-ATP-binding pocket of GsK-3B like TDZd 8. The discovered new active compound (4c)is structurally different to other inhibitors of GSK-3B and worthy of further study as a novel lead compound Key words: Glycogen synthase kinase-3B, inhibitor, virtual screening, synthesi

10 Design, synthesis and in vitro test of 2, 3-dihydrobenzo[b][1, 4]thiazepine-4(5H)-ones as novel non-ATP competitive glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β) inhibitors Huang Zhaohui1#, Hu Hairong2#, Lei Jiayi1 , Chu Yong1 *, Ye Deyong1 * 1: School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai, China, 200032 2: School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai, China, 200433 Abstract Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that has recently emerged as a key target for neurodegenerative diseases and diabetes. Most of known inhibitors are bound in the ATP-binding pocket of GSK-3, which might lead widespread effects. Non-ATP-competitive GSK-3 inhibitors actually represent a more efficient pathway for providing real promising drugs for therapeutic intervention. As an initial step of our work to discover such non-ATP-competitive GSK-3 inhibitors, a virtual screening was conducted by Autodock program, which docked the small drug-like molecules of Maybridge library at the non-ATP-binding site of GSK-3β. 2, 3-Dihydrobenzo[b][1, 4] thiazepine-4(5H)-ones (1) with variable substitutes ranked in the top of hits, likely potentially having inhibition and highly selectivity to GSK-3β. Eight derivatives of (1) had been designed based on the virtual screening result and successfully synthesized through Knoevenagel reaction, cyclization and N-alkylation. Among them, 5-benzyl-2-(furan-2-yl)-2, 3-dihydrobenzo[b][1, 4] thiazepin-4(5H)-one (4c) showed moderate inhibition to GSK-3β in vitro (IC50: 47.69 ± 2.38µM) tested by the National Center for Drug Screening of China. Further Docking study showed 4c can bind to the specific non-ATP-binding pocket of GSK-3β like TDZD 8. The discovered new active compound (4c) is structurally different to other inhibitors of GSK-3β and worthy of further study as a novel lead compound. Key words: Glycogen synthase kinase-3β, inhibitor, virtual screening, synthesis 中国科技论文在线 http://www.paper.edu.cn