上海交通大学学报(医学版 Journal of Shanghai Jiaotong University( Medical Science Vol 30 No. 4 A 文章编号:16748115(2010)04-0408-07 论著 人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUI贶7局部结构模拟和突变 分析 方风琴',谢琼2,张玥,毛客自,章莉',陆怡德',华丽',曹国君',季育华 (1.上海交通大学医学院瑞金医院检验科,上海200025;2.复旦大学药学院,上海200032) 摘要:目的初步探索人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部序列(329-572a)的三维模拟结构并进行突变的耐药分析。 方釆用巢式PCR方法扩增UL97基因776bφ片段并测序,以此发现非同义突变;然后利用 SwISS- MODEL结构模拟综合服务 器和其他相关软件比对模式对野生型PULΩη蛋白片段进行冋源模建并优化,通过各种指标或服务器来评估模拟结构的优劣并 作筛选。将筛选所得的最佳模拟结构用于非同义新突变型的初步耐药分析。豬果最终筛选出的模拟结构是以 IYDTE为模 板,以L. FASTA为比对文件所得的 Model A。整个分子的能量最低,Pro的预测分数最高。分子对接分析也发现了潜在的 ATP和GC结合口袋。利用已知的阴阳性耐药点突变验证了该结构的合理性。同时根据突变前后结构信息的改变,提示 C518Y单点突变以及联合突变(E517G和C518Y)呈现高度可疑的耐药特性。豬论PUL97野生型蛋白计算机结构模拟和突 变分析法是初步评估新突变型耐药特性的又一方便快捷的方法,可用于实验验证前的筛选;但模拟结构本身的准确性是成功 运用该方法的前提。 关键词:人巨细胞病毒;PUL97蛋白;三维结构模拟;突变分析 中图分类号:Q816;TP31.1 文献标志码:A Modelling of partial structure of human cytomegalovirus PuL97 protein and drug resistant analysis of new non-synonymous mutations FANG Feng-qin, XIE Qiong,, ZHANG Yue, MAO Ke-zi', ZHANG Li, LU Yi-de. HUA Li, CAO Guo-jun' JI Yu-hua (I. Department of Clinical Laboratory, Ruiyin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025 China; 2. College of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032, China) Abstract: Objective To preliminarily explore the 3-dimensional modelling of partial structure(329-572aa)of cytomegalovirus PUL97 protein and elementarily analyse the possibility of drug-resistance of new non-synonymous mutations. Methods Nested PCR was employed to amplify 776 bp fragment of UL97 gene. And some non-synonymous mutations in it were found by sequencing. After that, the online server of SWISs-MODEL and other related softwares were used for modelling and g ucture of wildtype PUL97 protein based on the alignment mode. Then, the modelled structures were evaluated and screened by various classical indicators or online servers. Finally, the best structure was obtained and ployed for preliminarily analysis of polential drug-resistant possibility of non-synonymous mutations. Results the finally-screened model was Model A based upon the template of I YDTE and the alignment file of LI, FASTA. The whole energy of the structure was the lowest, while the prediction result of ProQ was on the top compared with the rest. Using the method of molecular docking, the potential binding sites of ATP and GCv were found in it. And most important, the mutation analysis based upon the modelled structure and positive/negative drug-resistant mutations confirmed that this structure was reasonable. Finally, the newly-found mutations namely, point mutation C518Y and combined mutation E517G/C518Y)showed some evidences of having the possibility of drug-resistance under the benefit of the above established system. Such evidences were the significant differences in structural information before and after mu Conclusion The above-described system of PUL97 structure modelling and mutation analysis is the valuable and 基金项目:上海交通大学医学院2007级博上:点基金(BXJO13);上海市科委重大基础研究项目(074119521)(2007 Doctorial Grant of Shanghai Jiaotong University School of Medicine, BXJO813 Major Fundamental Research Program of Shanghai Science and Technology Committee, 074119521) 作者简介:方风琴(1982—),女,博土生;电子信箱; fengqin999@126,com 通讯作者:季育华,电子信箱:riyh@yahoo.com. C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
方风琴,等:人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析 method for preliminarily predicting the possibility of drug-resistance of new mutations. It is more convenient and quick, and can be regarded as the screener before experimental verification. However, the accuracy of modelled structure itself is the on of this system Key words: human cytomegalovirus; PUL97 protein; 3-dimensional structure modelling: mutation analysis 随着现代移植医学的迅猛发展和新型免疫抑制酸易发生同源重组的性质,将克隆的突变分子引入 剂的不断推出,移植已经成为许多终末器官疾病以HCMⅤADl69株,并通过药物筛选平台,获得突变的 及血液病重要的治疗手段。感染和排斥一直是移植重组HCMⅤ并验证与耐药的相关性。事实上 医学面临的两大问题,其中人巨细胞病毒( human HCMV是人类最大的病毒之一(230kb),顺利完成分 cytomegalovirus,HCMⅤ)内源性潜伏一激活感染的控子转移实验并获得预想的突变株,在技术或成本等 制是重点之一。中国人群HCMⅤ的感染率高达90%方面都要求较高,而且费时费力。若用计算机技术 以上,健康带毒者无碍其生命及生活质量。但是,在对HCMⅤ耐药相关蛋白PU97三维结构进行模拟 免疫低下的群体中(如婴幼儿及越来越多的移植患并利用得到的模拟结构对非同义新突变前后的结构 者),特别是受到同种异体移植物的刺激时,病毒极或功能改变进行分析,有助于对新突变型的耐药性 易呈现激活感染,引发全身各脏器的病变以及移植作出初步预测。对预测结果提示有耐药可能性的突 物失功,甚至危及生命 变型,再通过病毒重组实验验证,这样可节约大量的 考虑到移植群体持续的免疫抑制以及HCMV病时间和成本,并给临床治疗一个早期提示。 所带来的严重后果,预防措施显得至关重要。日前, 蛋白质结构预测在医学或生物学各个领域有着 临床上主要采用两种方法:预防性用药和干预性用成熟的应用经验。2006年,有研究”已经对HCMV 药2。不管是哪种措施,抗HCMV药物的长期暴露DNA聚合酶(PUI54)三维结构进行了预测。因为在 似乎不可避免。但由于这些药物的高昂价格和对骨PDB数据库已经存有大量的聚合酶晶体结构,很容 髓抑制的不良反应,往往导致临床医师在用药时剂易就能找到与HCMⅤDNA聚合酶序列同源性高的 量偏小或者疗程不足。长期低剂量、间断性的暴露模板;此时利用 SWISS MODEL中 automated mode模 和机体持续免疫力低下使耐药株得以筛选和复制,式就能预测岀可靠的三维模拟结构,用于U54基因 最终演变成进行性或致死性HCMV病。据国外资料新突变点的耐药性预测。而对于PU197蛋白,虽然 统计,在所有移植群体中,HCMⅤ耐药发生率高达前在PDB库中还没有同源性很高的模板,但是从 10%左右31 2003年至今已经有人陆续注册PUL97局部的或粗略 UL97为HCMⅤ最主要的耐药相关基因,其编码的模拟结构。本研究就该野生型蛋白244个氨基 的蛋白PUL97为一种激酶,底物广泛,包括病毒或宿酸(329~572a)的三维结构作一初步探索,并以此 主编码的蛋白以及小分子药物,如更昔洛韦( gancI--为基础分析非同义新突变的耐药特性 clovir,GCV)等。GCV必须先经过PUI97蛋白的磷酸 1材料与方法 化,才能继续被细胞激酶磷酸化,最后才能抑制DNA 聚合酶。若发生GCV耐药,90%是U197突变所致3。1.1标本来源及处理 因此,U197基因是研究GCV耐药的重要靶点3 1.1.I标本来源:为外周抗凝全血标本,参与UI97 中国人群HCMⅤ感染有其自身特点,如潜伏感PCR扩增的标本近1000份,而能得到条带并测序的 染率高,导致移植类型以D+/R+为主,缺乏耐药极标本只有近200份。这些标本主要来自上海交通大 其重要的易感因素(D+/R-)2‘3。尽管国际公学医学院附属瑞金医院造血干细胞移植或肾移植患 认的有效抗HCMⅤ药物种类有限,但是我国临床医者,少部分来自肝移植或心脏移植患者。这些患者 师的用药剂量疗程、时段均有自身的特点。根据目多数采用系列跟踪方式,采血时间间隔1周~1个 前的部分研究结果,我国移植群体UL97非同义突变月。干细胞输注前准备一般采用清髓方式,输注前 率虽然与国外无异(排除已经证实的多态性位点),但10d进行静脉注射GCV预防(250mg,Bid),然后口 其中近一半位点不同于国外报道,尤其是C518Y单突服阿昔洛韦( aciclovir,ACV),若出现血浆HCMV 变及E517G/C518Y联合突变在人群中占一定比例 DNA阳性,则改用缬阿昔洛韦(ACV)或静脉注射 验证新突变位点与耐药的相关性,最经典的方GCV。免疫抑制方案一般采用环孢素( cyclosporin A 法就是分子转移病毒重组技术6。即利用病毒核CsA)+霉酚酸酯( mycophenolate mofefil,MMF;商品 o1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
上海交通大学学报(医学版) VoL 30 名为骁悉),若出现Ⅱ度及以上移植物抗宿主病自动模式只要提交待模拟序列即可,但是靶序列与 ( graft versus host disease,GVHD),主要用甲基强的松模板序列之间的同源度要求最高。比对模式需要人 龙( methylprednisolone,MP)或强的松( prednisone,为寻找合适的模板(可以为多个),然后建立靶序列 Pred)治疗。肾移植一般采用三联免疫抑制方案,即与多个模板之间的比对文件,最后将比对文件、靶序 CsA+MMF+Pred或者他克莫司(FK506;商品名为列以及最优的一条模板序列共同提交给服务器;比 普乐可复)+MMF+Pred,手术后一般采用ACV预防对模式所要求的同源度可相对较低,但至少应有 HCMV,若出现 HCMV DNA阳性,则改用VACV或静15%~20%。组合模式需要提交一条靶序列与一个 脉滴注GCV治疗。 或多个模板的重叠三维结构以及靶序列与模板序列 1.1.2标本处理:全血标本量为2~3mL,首先利用之间的比对文件,主要用于结构模建后的优化。本 低渗原理将0.8%氯化铵(NH4Cl)按(5~10):1比例研究主要采用的是比对模式 与全血混合,彻底裂解红细胞,通过反复离心和PBS1.3.3PDB数据库:为蛋白质晶体结构数据库,任 洗涤获得白细胞团。然后用传统的苯酚-氯仿抽提法何模拟结构都不被收亼。同源模板就是在PB库中 抽提白细胞中的核酸(包括细胞和病毒基因组)寻找。而 SWISS-MODEL已经整合了自身的PDB库 ( ExPDB库),方便其直接寻找同源模板。 1.2U97基因扩增和测序针对含有大量白细胞1.3.4模拟结构评估系统:SWSS- MODEL本身带 的基因组背景以及该基因G+C比例偏高导致PCR有三个模拟结构区段评估指标,即 Anolea, Gromos和 相对难扩的特点,本实验室建立了巢式PCR方法。外Veiy3D。 Anolea主要用于评估三维结构的折叠质 围前引物1038F:5 CTGCACAACGTCACGGTACATC3,量,y轴代表每个氨基酸的折叠能量,负值表示处在 外围后引物1038R:5- CTCCTCATCGTCGTCGTAGTC有利的能量环境中,正值表示处在不利的能量环境 C-3’;内围前引物76F:5 GTTGGCCGACGCTATCAA中。 Gromos主要用于评估经验力场能,y轴代表蛋白 AT3,内围后引物76:5’ GGTCCTCCTCCCAGATTA链中每个氨基酸的经验力场能,负值和正值分别代表 TG-3’。两轮的PCR反应程序均为:95℃10min;该氨基酸处于有利的和不利的能量环境中。 Verify3D 5℃30s,55℃30s,72℃70s,共35个循环;最后代表每个原子的三维结构与其所在的氨基酸序列 2℃延伸7min。第二轮PCR总体系为25μL,其中(一维结构)之间的兼容性,分值为-1-+1,兼容性 3μl模板来自第一轮PCR的反应产物。两轮后所由差到好。此外,还有一个PQ结构质量预测服务 得PCR片段长度为776bp,在UL97基因中位置是器操作网址htp://www.sbe.su.se/-bjorn/ProQ 1399-2068nt(核苷酸),即467-689a(氨基酸)。 ProQ. html,主要计算两个参数,即 LGscore(结构正 该段序列涵盖了U197基因的高突变区(包括有义突确>1.5;结构良好>3;结构优秀>5)和 MaxSub(结 变和无义突变)3。测序由英骏公司( Invitrogen)完构正确>0.1;结构良好>0.5;结构优秀>0.8),优 成,所用仪器为ABI3730。每个标本正向(前引物)势在于尽量找到合理且正确的结构,而不是尽量去 和反向(后引物)各测1次,确保测序无差错。同时找该蛋白的结构原形。 每个标本均进行2次独立扩增,确保无污染 1.3.5 Deep view( Swiss-Pdb viewer3.7):是一种蛋 1.3蛋白三维结构模拟的相关软件或在线服务器白三维模拟结构的查看、调整和优化软件。由 1.3.1 Clustal X1.83:是一个 Windows界面的多重 SWISS-MODEL网站免费提供下载。 序列比对软件(包括核苷酸序列和氨基酸序列)。但1.3.6 Autodock:是一种最权威以及使用最广泛的 是导入的序列格式必须是FAS格式,而不能是SEQ或分子对接软件,主要用于小分子(如药物)与大分子 PRO格式。在 DNA STAR中可进行格式间的转换。 (如蛋白质)之间的对接,具有优化模拟结构的功能。 1.3.2 SWISS- MODEl!H':是三维结构模拟软件,同该软件操作、分析由复旦大学药学院协助完成。 时也是一个免费的综合在线服务器,操作网址为 hp:/ wissmodel. expasy.org/,由瑞士生物信息学研 究所研发。它主要根据序列决定构象、构象决定功2.1U97基因序列中存在非同义新突变在 能、同源序列有相似构象的原理进行同源模建。模PUL97蛋白520号氨基酸附近发现有义突变:518号 建方法主要有三种:自动模式( automated mode)、比位置的氨基酸从半胱氨酸(C)变为酪氨酸(Y),所占 对模式( alignment mode)以及组合模式( project mode)。比例为1%~2%。此外,还发现517和518号位置氨 S1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
方风琴,等:人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析 41I 基酸有联合突变,前者从谷氨酸(E)变为甘氨酸518aCY);所占比例约1%(2/200)。但从未发现 (G),后者从半胱氨酸变为酪氨酸(即517aEG和517位氨基酸单独突变。阳性测序结果见图1 C园A心匠GTT AA反 AT T AC C6丘AT 图1UL97基因517和518号位置密码子的非同义突变 Fig 1 Non-synonymous mutations found in UL97 gene at the position of 517aa and 518aa λ:野生型序列;B:UL97基因518号位置密码子从TGr(C为半胱氨酸)变为TAT(Y为酪氨酸);C:517和518号位置密码子同时发生突变 前者从GAA(E为谷氨酸)变为GGA(G为甘氨酸),后者从TGT变为TAT。 2.2选择待模拟区段及寻找同源性较高的模板 的同源度并不很高时。一般来说,最好的比对结果 2.2.1分析并选择待模拟的区段:通过对实验株就是能找到最多的同源点。 PUL97蛋白的保守结构功能域2以及PDB数据库2.3.2比对模式的同源模建:将所得的比对文件提 中现有的三维结构资源的深入分析,选用329~572交给SWSs- MODEL服务器,同时从中选择一条模板 位氨基酸序列作为模拟靶序列。这一区域不仅是序列。该服务器会自行演箅并优化,得出模拟结构 PUL97蛋白重要的功能区域(该段序列涵盖了同一模板,不同的比对文件会得到不同的模拟结构 PUI97蛋白I~Ⅸ亚域)12),同时一些已验证的高频同一比对文件,不同的模板也会得到不同的结构。 率、高耐药的突变型(如M460V、H520Q)也落在此区该服务器在给出“pdb”结构数据的同时,还会给出 域。此外,一些新发现的非同义点突变也落在该区 Anolea、 Gromos以及veri3D等评估数据。初步筛 域,位于Ⅶ/Ⅷ亚域,该保守骨架在细胞激酶中缺失,选后,ProQ服务器可作进一步的预测和淘汰。图2 被认为是CCV结合的可能部位2 是经过筛选后得到的3个最优结构,模拟残基数为 2.2.2寻找同源性较高的模板:直接利用SwSs-244个氨基酸,筛选体系为SWSs- MODEL自带的评 MODEL链接的PDB模板库,找到了一些同源性较好估指标以及PoQ服务器。 Model A和B是根据同 的模板。因为没有同源程度特别突出的模板,为了个模板和不同比对文件得出的不同结构。这三个模 尽量不遗漏PDB库中已有的结构信息,以及最大程拟结构的Pro预测档位基本一致( LGscore位于“良 度地反映该蛋白直实结构,选择同源性较好的不同好”档, Max Sub位于“正确”档),均属于可接受范围 类型的多个模板,预备在结构模建时采用比对模式。2.4PUL97模拟结构 Model A与小分子ATP/GCV 根据软件给出的e值(e值越小,同源性越好),各种的对接利用 Autodock软件先优化上述三个模拟结 模板蛋白的功能类别以及二级结构同源度等信息综构,然后采用分子对接技术寻找该蛋白结构中理论 合分析,最终选择了以下12条模板:2c47A(2c47为上应存在的ATP或者GCⅤ结合口袋,作进一步筛 PDB编号,A为蛋白链编号)、2chA、2cmwA、1ckiA、选。已经证实PUL97为一种激酶蛋白,它不但能使 I vow、191A、1z57A、2euA、 I wakA、 IYDTE、1TKIA各种病毒或宿主蛋白底物磷酸化,还能使本身以及 和1TQIA。同源e值均在c09至e-11之间,序列同GCⅴ磷酸化。该蛋白一直被认为存在ATP以及 源度为10%~20%。在具体比对时,可以只选择其GCⅤ的结合口袋,而且这些结合区位于该模拟区段 中一部分,以最终得出的模拟结构优劣为标准。 内的可能性很大13。对三个模拟结构优化后进行 2.3同源比对及模建利用 Clustal X1.83软件将分子对接,发现只有 Model A结构具有结合ATP或 靶序列与多个模板序列进行同源比对,然后将比对GCV小分子的较大可能性,其对接分数分别为75 文件递交给SWSS- MODEL进行比对模式的同源和48(100为满分)(图3),而其余结构能同时具备 模建 两种口袋的可能性很小。对接能将口袋进行初步 2.3.1同源比对是关键:同源模建的准确性很大程定位,但定位结果与理论上推测的结合位置有一定 度上依赖于比对结果,特别是当靶序列与模板序列偏差 o1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
。上海交通大学学报(医学版 B C的一系列图(包括阳性耐药点突变以及新发现的非 同义点突变和联合突变)显示,上述三个方面的结构 信息都发生了或多或少的显著性改变。这不仅证实 了阳性点突变的结构信息改变吻合了其耐药特性 也提示新发现的非同义点突变或联合突变产生耐药 的可能性很大,但并没有找出一个量化的指标从而 图2从不同比对文件和不同模板所模建的一组结构中筛选出的给出一个界值来判定是否发生质变。如果对接效果 3个最优结构 Fg2 Three optimal modelling structures selected from a group of理想,可以根据点突变对分子对接造成的影响进行量 structures modelled on difTerent alignments and templates 化;但对接效果不够理想。另外,本实验室已经利用经 A:以U. FASTA为比对文件,以YDTE为模板的模建结构( Model典的病毒重组实验证实了C518Y点突变的耐药特性 A);结构命名:329572-U197 YDTE-LI. FASTA;ProQ预测结果 LGscore4.197, MaxSub0.344;B:以J3. FASTA为比对文件,以 IYDTE为模板的模建结构( Model b);结构命名:329572-U197 IYDTE刂3. FASTA;Pro预测结果: LGscore4.152, Maxsub0.329; C:以 NI FASTA为比对文件,以lckA为模板的模建结构( Model C) 结构命名:329572-U97ckiA-nl. FASTA;PmQ预测结果: LGscore 3.960, MaxSuh0.254 2.5利用筛选出的最优模拟结构对新发现的非同 义点突变进行初步耐药分析为了验证该模拟结构 的可靠性,利用已知的耐药相关点突变(M460V以及 图3PUL97蛋白局部模拟结构 Model a与小分子ATP/GCv的 H520Q)和耐药无关点突变(V354A21)作为阴 对接 性和阳性对照,分析其氨基酸突变前后的结构信息Fig3 Docking results of PUL界7 ocal modelling structure Model A (包括结构框架、范德华力大小及作用范围、氢键等 with small molecules atp or Gcv 方面)是否发生有意义的改变(图4)。从图4A/B中 A: Model A与小分子ATP的对接图,对接分数为75分;B: Model a 与小分子GCV的对接图,对接分数为48分。绿色或蓝色的细线条为 可以看出354位氨基酸从缬氨酸(V)变为丙氨酸局部蛋白主链;中间线条较粗的球棒结构为GCV或ATP分子;桔黄 (A)时,上述三个方面的结构信息都没有发生显著改色或藍色的英文字母及数字为氨基酸缩写名及其在链中的位置(全 变,与其突变前后对药物敏感性不变吻合。而之后长为244个氨基酸)。 图4对新发现的非同义点突变或联合突变进行耐药分析 Fig 4 Analysis of drug-resistant possibility of newly-found mutations using finally-screened modelling structure A、B为耐药无关点突变(V354A)的突变前后结构信息对比;C、D和E、F分别为耐药相关点突变H520Q和M460V突变前后的结构信息对比 G、H和I、J分别为新发现的非同义点突变C518Y和联合突变(E517G,C518Y)的突变前后结构信息对比。绿色的线条为蛋白主链;粉色的线条为 氢键;红色的线条或蓝色的线条(见I、)为靶氨基酸(即待分析的氨基酸)的主链和支链;点状图案为靶氨基酸所具有的范德华力的大小和作用 范围;图中的字母和数字为靶氨基酸的缩写及其在链中的位置 S1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
方风琴,等:人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析 评估方法使得蛋白结构模拟可靠性越来越强,可替 3讨论 代真实结构解决的问题越来越多。 HCMⅤ潜伏再激活和HCMⅤ病处于移植后病毒 但是,PUI97蛋白模拟系统最大的不足是,PDB 感染的首要地位。临床上,GCⅤ等抗HCMV药物显库中的模板与PUI97蛋白序列同源度不是很高,只 示了良好的治疗和预防作用,但这些药物的广泛及有10%~20%。但是,我们可以利用各种现有的方 非规范化使用导致耐药株不断出现。若不及时控制法来部分弥补这一缺陷对结构准确性所带来的影 耐药株感染,与移植物排斥形成恶性循环,严重威胁响""6'。① SWISS- MODEL实际上也部分整合了二 到移植物以及患者的存活 级结构同源的模建原理;②多个模板序列参与的比 但至目前为止,国内外仍没有建立良好的耐药对模式实际上部分起到了分段模拟的效果; 监测方法。表型检测(主要是蚀斑试验)耗时长,由③ SWISS-MODELA本身对模建后的结构也有很好的优 于培养过程的不确定性,并存在较强的主观因素及化系统,同时 AUTODOCK软件也能对模拟结构进 缺乏标准化,使其在临床上的实用价值较小。基因步优化;④各种评佔服务器以及 SWISS- MODEL自带 型方法(主要是全基因测序)对耐药基因的检测较成的评估指标,特别是与小分子药物的对接分析等都 熟,结果客观且耗时较短,是一种有临床实用价值的为模拟结构的筛选设定了标准。因此,经过不断地 监测方法。但是,只能根据序列对已验证的耐药相优化分析以及重重地筛选,所得到的模拟结构理论 关突变作报告从而指导临床用药。当出现新的突变上基本具备了对新突变型进行初步耐药分析的条 位点或种类时,无法对其耐药性进行评估;而且目前件。但是,对于结构信息改变不敏感的单个氨基酸 较明确的UL97基因耐药谱基本是根据国外的HCMⅤ突变,分析时需谨慎。我们相信,随着PDB库中模板 流行株得出的(括号内为突变型的发生频率和C50信息的不断增加及模板与PUL97序列同源度的不断 药物浓度相对于敏感株的倍数):A594V(30% 提高,计算机的耐药分析方法会变得愈加正确和 34.5%,10.7)、L5955(20%~24%,4.9~11.5 M460V(11.5%-14.5%,7)、H520Q(5%~11.5% 另外,PUL97蛋白的功能盲点也为其结构模拟 10)、C592G和C603W等3。根据前期的研究,国内增加了一定的难度。PUL97是HCMV的功能蛋白 HCMⅤ流行株的UL97基因非同义突变近50%不同具有磷酸转移酶的活性,其总长度是707个氨基酸 于国外报道,而这些新的突变点主要集中在该模拟N端(大致是1-328aa)主要包括细胞核内定位信 区段内。对于不断发现的新突变点,需要花费大量号;中间区(329~Xaa,具体划分到哪里不明确,有可 的时间和精力通过生物学实验加以輪证。但是,临能至459a)主要是蛋白激酶域,缺失这部分区域对 床对数据的迫切需求促使我们利用已知的数据建立任何底物的磷酸化作用都将丧失。因此,据推测,该 一种快速的计箅机预测方法,对新突变点作出相对区域理论上存在ATP结合部位。C端具体从哪里开 可靠的预测,从而及时指导临床调整治疗方案。而始不是很明确,各种实验现象都表明该区域主要与 且,若所得模拟结构准确性较高,可用于计算机新药GCV的磷酸化有关。但是,是不是存在GCV的结合 筛选,有着巨大的商业价值。目前,最大的好处是,区域,如果存在这一区域,主要位于C端的哪个部 如果计算机在野生型蛋白模拟结构的基础上对新突位,这些问题目前仍然处于猜测阶段。目前,主流的 变点的耐药潜能作出较可靠的预测,就可以大大降观点还是认为C端存在GCV结合区。我们模拟的 低实验验证的盲目性以及减少工作量。 蛋白区域为329~572a(Ⅰ~Ⅸ亚域),很明显包含了 结构模拟是一种过渡方法,这种方法的存在有假定的ATP结合域,而且根据 Michel等的观点, 其强大的知识体系支撑。如序列同源导致三维结构PUL97蛋白Ⅶ/Ⅷ亚域为细胞激酶的“缺失区”,推 相似和功能相似;即使序列同源度较差,若二级结构测很可能是GCV的结合区域。因此,从现有的数据 同源,也有足够的理由导致相似的三维结构及相似资料以及理论推测上来看,模拟的蛋白区域很可能 的功能。关键在于二级结构的折叠类型非常有限,包含了ATP和GCV的结合位点(尽管目前还没有办 再加上分子对接技术的发展(基于蛋白发挥某种功法用数据证实这一点)。而本研究恰恰利用了上述 能往往会与其他物质发生亲密接触的特性),PDB库的可能性作为筛选模拟结构的一个辅助条件,这是 中模板不断增多以及各种生物信息学强大的模建和该系统的亮点,也存在一定的风险。其实 Model B和 o1994-2011ChinaAcademicjOurnalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
4I4 上海交通大学学报(医学版 Vo.30 C与ATP的结合分数也不高,若不考虑GCV结合分6 Chou S,EceA, Jordan MC,etal, Analysis of the U97 phospho 数,选择 Model A也是理所当然。另外,分子对接软 transferase coding sequence in clinical cytomegalovirus isolates and 件实际上可以对小分子结合部位进行定位,但是图3 dentification of mutations conferring ganciclovir resistanee [J]. J Infect Dis,1995,171(3):576-583 显示可能与GCV相互作用的氨基酸只有少部分位于(71chs. Van Wechel IC.tiyw,ea. Phenotyping of cyto- C端,而且这些氨基酸与已验证的耐药位点不是很相 megalovirus drug resistance mutations by using recombinant viruses 符。因此,PUL97突变型的模拟结构与小分子的对 incorporating a reporter gene[ J]. Antimicrob Agents Chemother 接也没有进行下去。但在缺少上述对接数据的情况 0-2715 下,直接从模拟结构的突变前后结构信息改变上发 [8]Jones DT. Protein structure predietion in the postgenome era[J] 现了一些可喜的结果。阴、阳性点突变均出现了与 Curr Opin Struct Biol, 2000, 10(3): 371-379. 耐药特性不吻合或吻合的结构信息改变,而且这些 egalovirus DNA polymerase and preliminary analysis of drug resis 经临床资料提示具有耐药可能的新突变或联合突变 tance[J]. Proteins,2006,64(2):301-307 (C58Y;E517G+C518Y)也出现了显著的结构信息101 Comaker D, Schlegel v, Maurer K,eta. Analysis of the structure. 改变。最重要的是,本实验室也已经用病毒重组实 activity relationship of four herpesviral U1.97 subfamily protein kina- ses reveals partial but not full functional conservation[ J].J Med 验证实了C518Y的耐药特性。 综上所述,该模型尽管有很多局限性,但事实证[1] Schwede t,KopJ, Guex N,etl. SWISSMODEl1: An automated 明了它的可靠性和有效性,整个平台为临床检验领 protein homology-modeling server[ J]. Nucleic: Acids Res, 2003 域带来了新思路和潜在的应用价值 31(13):3381-338 [12] Michel D, Kramer $, Hahn S, et al. Amino acids of conserved kinas motifs of cytomegalovirus protein UL97 are essential for autophospho- 参考文献 lation[J]. J Virol,1999,73(10):8898-890 I] Reeves M, Sinclair J. Aspects of human alovirus latency and [13]Michel D, Schaarschmidt P, Wunderlich K, et al. Fu reactivation[ J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2008, 325: 297 of the human cytomegalovirus protein pUL.97 involved in nuclea localization and phosphorylation of ganciclovir and pUL97 itself[J] [23 Boeckh M, Nichols WG, Papanicolaou G, et al. Cytomegalovirus in Gen virol,1998,79(P9):2105-2112 hematopoietic stem cell transplant recipients: Current status, known [14]Baldanti F, Michel D, Simoncini L, et al. Mutations in the UL97 challenges, and future strategies[J]. Biol Blood Marrow Trans- ORF of ganciclovir-resistant clinical cytomegalovirus isolates diffe plant,2003,9(9):543-558 tially affect GCV phosphorylation as determined in a recombinant [3]Gilbert C, Boivin G. Human cytomegalovirus resistance to antiviral accinia virus system[ J]. Antiviral Res, 2002, 54(1): 59-67 drugs[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3):8738 [15 Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL, Work space: A web-based environment for protein structure homology [4]Chou S. Cytomegalovirus UL97 mutations in the era of ganciclovir modeling[ J). Bioinformatics, 2006, 22(2):19.5-201 and maribavir[ J]. Rev Med Virol, 2008, 18(4):233-246 [16]Kiefer F, Amold K, Kunzli M, et al. The SWISS-MODEL repository [5]Avery RK. Ganciclovir-resistant cytomegalovirus disease in heart and associated resources [J]. Nucleic Acids Res, 2009, 37(Database transplant recipients: the dilemma of donor-positive/recipient-nega- tive serostatus[ J]. Clin Infect Dis, 2007, 45(4): 448-449 收稿日期:200910-7 本文编辑:周珠风 C1994-2011ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net