高等学校化学学报 201l年8月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1779~1784 新型多巴胺D3受体抑制剂的发现 邓欣贤,沈庆1,徐丽丽,熊子君1,赵伟利,镇学初2,付伟 (1.复旦大学药学院药物化学教研室,智能化递药教育部和全军重点实验室,上海201203; 2.中国科学院上海药物研究所,上海201203) 摘要根据最新解析的多巴胺D3受体的晶体结构进行活性位点分析,建立了基于受体的药效团模型,并对 Asinex gold collection数据库进行筛选,选择7个化合物进行生物活性测试,得到了高活性新型多巴胺受体 抑制剂(04932482),它对多巴胺D受体抑制率达85.45%,其K值为(806.75±34.58)md/L进一步对活 性化合物进行结构分析,研究了其与受体相互作用的模式,并以此为指导提出以04932482为先导化合物进 行结构改造的方向 关键词多巴胺D受体;药效团模型;数据库筛选;抑制剂 中图分类号0643 文献标识码A 文章编号025140790(2011)08-177906 精神分裂症是一种严重的精神类疾病,每年全球的发病率在0.5%~1.5%之间.精神分裂症分 为阳性症状和阴性症状.阳性症状表现为妄想、幻觉和躁动等,阴性症状与之相反,表现为感情冷漠 认知障碍和行为迟钝等,其中注意力和记忆力明显下降是这种症状的突出特点.20世纪50年代,第 个治疗精神分裂症的化学治疗药物氯丙嗪( Chlorpromazine)被发现,该药主要作用在中枢神经多巴胺 D2受体上,对于精神分裂症的阳性症状有较好的治疗作用,对阴性症状的疗效甚差,且椎体外系症状 ( Extrapyramidal symptoms,EPS)的发生率高,故称为经典抗精神病药.20世纪70年代问世的氯氮平 ( Clozapine)的作用靶点主要是中枢神经多巴胺D2受体和5HT2受体2-4.该药不仅对阳性症状有良好 的治疗作用,而且对阴性症状也有较好的改善作用,成为第二代抗精神病药物,又称非经典抗精神病 药或非经典安定剂( Atypical antipsychotics).氯氮平虽然具有很好的疗效,但由于其曾引起严重的粒细 胞减少症而一度退出市场.为避免前两代抗精神病药物所致副作用,新型抗精神病药物应具有新作用 靶点特征.脑内多巴胺D3受体主要调节多巴胺的合成和释放,对情感、认知及运动机能等众多神经活 动发挥着重要的调节作用,并参与精神性疾病如精神分裂症、帕金森病和药物成瘾的发病过程.通过 基于药效团模型的虚拟筛选发现D3受体抑制剂,对开发精神类疾病的药物具有很大的指导意义.D3受 体抑制剂作为新型抗精神病药物有以下优点:(1)较少地引起甚至避免了椎体外系副反应;(2)对患 者的认知能力有相应的改善作用;(3)对阴性症状有较好的疗效;(4)能同时治疗有药物成瘾性的病 人 本文根据最新解析的多巴胺D受体的晶体结构,通过基于受体的药效团模型建立方法建立了药 效团模型,并用此模型搜寻 Asinex Gold Collection数据库,从中挑选化合物进行生物活性测试,得到了 具有D3受体抑制活性的先导化合物.对测试结果较好的化合物进行了分子对接,讨论其与受体的作用 模式,为以后的结构改造提供了指导 1实验方法 多巴胺能受体跨膜螺旋上存在高度保守的残基,各种活性分子通常作用在这些保守残基上η.不 收稿日期:2011405-25 基金项目:国家自然科学基金(批准号:20702009)、国家“八六三”计划项目(批准号:2009AA02Z308)和国家“九七三”计划项目 (批准号:2010cB912601)资助 联系人简介:付伟,女,博士,副研究员,主要从事计算机辅助药物设计研究.E-mil;wei@ gmail
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1780 高等学校化学学 Vol 32 同的分子作用在相同的受体上会引起受体结合口袋的构象变化,分子结构上的细微变化有可能引起分 子与受体结合模式上的巨大差异.因此,建立有效的药效团模型是指导先导化合物发现的关键.本 文采用如下研究策略:(1)从蛋白数据库( PDB Bank)上下载最新解析的多巴胺D3受体的晶体结构 并对其进行结构优化;(2)使用Gnd程序对D受体的活性口袋用不同化学探针进行探测,根据探 测结果使用 CATALYST4.10程序"建立药效团模型并进行数据库搜寻;(3)从搜寻结果中挑选化合 物进行生物活性测试;(4)将活性较好的化合物进行分子对接,得到分子与受体的作用模式,从而指 导下一轮抑制剂设计 1.1活性口袋性质分析与药效团模型的建立 利用CasP程序探测D3受体的活性口袋2,结果表明,活性口袋由第3,5,6及7跨膜螺旋组成, 与多巴胺受体配基晶体结构位置一致η.据此,将第3跨膜螺旋活性口袋中保守的Asp79~3周围1m 的区域定义为活性口袋.本文选取5种不同性质的典型化学探针:负电探针(COO-)、正电探针 (NI)、氢键受体探针(O)、氢键给体探针(N)和疏水探针(DRY)分别探测蛋白质中相应的正电、负 电、氢键给体、氢键受体和疏水性化学环境,并进行聚类分析.依据Grid探测的结合能和探针与受体 氨基酸残基的相互作用进行聚类分析,计算每一聚类探针的中心及半径,从而定义药效团模型的药效 团特征及区域.本文所建立的药效团模型的正电中心与受体中最保守的残基Ap79之间的距离为 0.33m,形成保守的静电吸引作用.此外,在保守残基Asp793,Phe2731,Phe228632,TpP2248 和Serl6134位置加入排除体积以避免和这些保守残基的碰撞 1.2数据库搜寻和分子筛选 根据药效团模型进行三维数据库搜寻,使用 CATALYST程序筛选 Asinex gold collection已知化 学品数据库.然后根据 Fit value、 G-Score、结构多样性以及类药性等5个规则,挑选出7个化合物进 行生物活性测试 1.3生物活性测试 使用 Spiperone作为阳性对照,所有待测化合物均用DMSO溶解配成浓度为0.01mol/L的溶液 并用去离子水稀释成100μmo/L的溶液.将10μ待测样品和带追踪分子的80μL受体分别加入反应 管于37℃水浴中孵化30min.然后立即将反应液放到冰浴中,停止反应.在 Millipore细胞样品收集器 中,使用GF/B玻璃纤维纸进行快速过滤,用洗脱液(50 mmol/L Tris-HCI,pH=7.7)洗涤3次,然后微 波干燥8~9min.用滤纸转移至离心管中并加入500μL荧光液.置于暗室中30min后,对其进行荧光 测定.计算出百分抑制率、IC30值和K值.每个样品分别进行2次独立的测试 1.4分子对接 使用GOLD-5.0.1软件对筛选出来的分子进行柔性对接.在对接前,使用 Sybyl软件的 Tripos力场 对小分子进行了1000步能量优化,并用 Gaussian2009的DFT/BLYP/6-31G力场对小分子进行结 构优化.利用遗传算法计算了分子的柔性键,每次计算均使用默认参数.最后使用GOLD软件 G-Score 对小分子进行打分 2结果与讨论 21多巴胺D受体活性口袋特征 运用 Delphis4.0程序对优化后的D受体进行静电势计算并用PyMl显示(图1).结果表明,多 巴胺D受体活性口袋为负静电势,主要为由Asp7932,Phe22731,Phe2863,Trp2244和Serl61342 保守残基组成的疏水口袋. 2.2药效团模型的建立 受体-配体之间的非共价相互作用主要有范德华力、疏水键、氢键和静电作用等.因此选择了具备 这些相互作用的典型基团作为探针,采用Grid程序对活性口袋进行探测.选取COOˉ作为负电探针 NⅠˆ作为正电探针,O作为氢键受体探针,N作为氢键给体探针,Dy作为疏水探针进行活性口袋探
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No. 8 邓欣贤等:新型多巴胺D3受体抑制剂的发现 1781 NI* Deteced cluste Fig 1 Electrostatic potential surface of Fig 2 Positive electricity cluster of the D, receptor receptor detected by N’ prob 测并进行聚类分析.结果表明,在第3号螺旋上Asp79·残基附近探测到正电团簇(图2),在膜外第2 个LoOP的Cys150附近存在氢键供体团簇.根据以上5种探针所探测出来的位点进行聚类分析,构建 了药效团模型.如图3所示,该药效团由1个与Asp7形成静电相互作用的正电药效团元素、1个氢 键供体及2个疏水元素组成[图3(A)].药效团模型很好地与D3受体活性口袋中保守残基形成静电及 氢键相互作用[图3(B)] (A) HYD. EXT-2 ,ICysl50 EXT-I 心 HYD-2 Fig 3 D, receptor pharmacophore (A) and the interaction between the pharmacophore elements and the key residues of the D, receptor(B) (A)3 Excluded volume (EXT), 2 hydrophobic center( HYD), I positive electricity center( POS )and 1 H-bond donor( HBD )are included. The distance between POS and HBD is 0. 559 nm, POS and HYD-I is 0. 561 nm, POS and HYD-2 is 0. 638 nm: (B) the distance between H-bond donor center( HBD)and Cysl50 is 0. 196 nm, the positive electricity center and Asp79-.is 0. 351 nm. The two hydrophobic centers are lying on the lipophilic pocket of the receptor. 2.3数据库筛选 Asinex gold collection数据库包含20000°个化合物,使用 CATALYST中的 catSear模块3对其 进行筛选,筛选结果如表1所示.根据拟合度及打分函数的排序结果,结合类药性五规则,挑选出7个 化合物进行生物活性测试 Table 1 Physico-chemical parameters, G-Score and fit value of the hits Entry H-bond donor H-bond acceptor AlgP Rotatable bond G-Score Fit value 04932482 464.54 02987623 4.373 38.55 03305462 412.49 05245768 409.48 3.545 0l199 Scoring by GOLD
) |}~*FGH *+XY vzAu(E ) ! / k2?u vwv |}~ + #utE D uS *+[@AdefzAu- k 2? \]Z[3E (*)4ut >?L MN¡VWXY[@A k2def3E ( )4 (!) " # ($) (*) 56#.$. 78$(59) %.%##$:$(; ) :7$$$#:#:#$:$(!). ;. .(; )$ #.$.%$.:#$$:$:?:%$$#$: !" *$6. /$#: 7¢£¤ (¥¦ /** ¡ #:$#% § ¨ *FG D©¥ª:«7¬=*F *¥} ®¯ °+ (¥¦ ±¦L % & '&( 5: /8. ;. . ;. ##$: *= @::$. #$ :7$ )* + &"& & , , " , & & )*+,- & " " & + + , ),-., &"" & " , , , " & ) ).- &, & , ," " , ) ))+) & & " +" + "" + , " )..,-+ & &, , & + , + )** && , & +& , + " 11A#= 0, 1 +,
82 高等学校化学学报 Vol 3 2.4生物活性测试 对选中的分子进行了生物活性测试,活性数据结果列于表2.化合物04932482对D受体有较高的 抑制率,达到85.45%,K值为(806.75±34.58)mmo/L.该分子与建立的药效团模型有较好的契合 (图4),其契合度为3.914 Table 2 structures of the hits and their bio-evaluation results Inhibition ratio( % Ky(nmol.L-) 04932482 806.75±34.58 O 02987623 22.9 01176572 0 03305462 Insoluble 3008103 05245768 81.66 2.5配体与D3受体的相互作用模式 首先使用Sybl69程序中的MMF4力场对化合物04932482进行结构优化,并用 Discovery Studio3.0程序进行离子化计算.结果显示该分子中与嘧啶环相连的氮原子所带的电荷为0.63,为分子 中质子化位点 使用GOLD-5.0.1进行小分子对接.结果显示,可质子化的与嘧啶环相连的N原子与第3螺旋上 p793保守残基之间的距离为0.245mm,形成较强的氢键作用(图5).化合物04932482中羟乙哌嗪
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邓欣贤等:新型多巴胺D受体抑制剂的发现 1783 0493248 Phc2201 Fig 4 Compound 04932482 matched into Fig 5 Interaction between compound 04932482 The excluded volumes are colored by grey and the hydrophobic The hydrogen bond formed between the compound centers are cyan. The H-bond donor is colored by purple and the and the receptor is shown as dotted line. 上的羟基与膜外第2个LOOP中的CYS150形成了氢键相互作用,距离为0.196m,表明该相互作用 比较强.苯并嘧啶与硝基苯结枃分别处于第5和第6跨膜螺旋上的Phe20,Tτp224-,Phe227和 Ph2282所形成的疏水口袋中,并分别与Phe2712和Tr22421形成r丌相互作用 抑制剂04932482与D受体的对接模式表明,对化合物进行改造应该保持化合物的羟乙哌嗪基团, 其嘧啶环相连的哌嗪环上的N原子与Asp79形成强静电相互作用.此外,其末端的羟基与膜外第2 个LOOP上CYS150残基中骨架上的羰基形成氢键相互作用.因此,对该类分子进行结构改造的部位 应为其结构中下端的苯环取代基团,此部位增加疏水性可增强其与周围疏水残基的π-π相互作用而增 加活性 结论 研究了基于多巴胺D受体晶体结构探测活性口袋的性质,建立了药效团模型,使用该模型筛选 Asinex gold collection数据库选择7个化合物,并进行生物活性测试,得到了2个对D受体有活性的化 合物.其中化合物04932482对D受体的抑制率为85.45%,K=(80675±34.58)mmo/L.进一步研 究了化合物04932482与D受体的相互作用模式,结果表明,该分子中哌嗪环上与嘧啶环相连接的N 原子与多巴胺D受体形成较强的静电作用,此静电作用为该分子与D受体识别的初始驱动力.最后, 根据药效团模型及该分子与D受体的结合模式提出了以该分子为先导化合物进一步进行结构优化的 方向 本研究发展了一套基于药效团模型的虚拟筛选方法,并对命中化合物进行了药理测试,验证了该 方法的有效性.这一方法也可应用于其它先导化合物的发现,可为药物发现提供一条可靠的途径 参考文献 [1] Abi-Dargham A, Laruelle M. European Psychiatry[J], 2005, 20(1): 15-27 [2]Horacek J. Pharmacopsychiatry[J], 2000, 33(Suppl. 1): 34-42 [ 3] Aghajanian G. K, Marek G. J. Brain Research Reviews[J], 2000, 31(2/3):302-312 [4]Reynolds G. P. Journal of Psychopharmacology[J], 2004, 18 (3): 340-345 [5] Joyce J. N, Millan M. J. Drug Discovery Today[J], 2005, 10(13):917-925 [6]Zhang M, Ballard M. E, Kohlhaas K. L., Browman K. E, Jongen-Relo A. L, Unger L. V., Fox G. B, Gross G, Decker M W., Drescher K. U, Rueter L. E. Neuropsychopharmacology[J], 2006, 31: 1382--1392 7]Huang E. S. Protein Science[J], 2003, 12(7): 1360--1367 [8]Dunn M. F. Handbook of Proteins[J], 2007,(2):678-69
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