5 浙江大学 遗传学第十二章 25 ㈡、λ噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列 为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。中间基因簇可被外源DNA 替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15kb外源DNA片段¨ 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： ♣不易引起生物危害，有助于 “目的”基因进入细胞并增殖； ♣携带大片段外源DNA分子， 占总量25%时仍不失活。 浙江大学 遗传学第十二章 26 ㈢、柯斯质粒(cosmid)： 噬菌体DNA ­ 部分细菌质粒DNA序列 ¨ 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。 这种质粒分子量较小， 但可接受长达50kb的外源 DNA片段¨克隆真核生物 基因。 ∵一个长片段DNA可能 具有真核生物基因的编码 序列及其它调控序列。 浙江大学 遗传学第十二章 27 指能在两种不同生物中复制的载体。 如能在原核生物(如E. coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列 (Auto-nomously replicating sequence, ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、 扩增基因，在酵母重用与基因表达 分析。 酵母菌的YEp (yeast episoma plasmid)等系列载体均是穿梭载体。 ㈣、穿梭载体（shuttle vectors）： 浙江大学 遗传学第十二章 28 ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)： BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子 改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。 特点： 带有外源DNA的BAC载体在 细胞中是单拷贝的； 载体分子量很小(7.4kb)； 选择标记：氯霉素抗性基因； 多克隆位点。 浙江大学 遗传学第十二章 29 ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)： 1996年完成了酵母菌 全基因组序列的测定。 YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受 100~1000kb的外源DNA片段。 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC) 的研究。 浙江大学 遗传学第十二章 30 pYAC4特点： 1. 两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 2. 酵母菌着丝粒序列(CEN4)； 3. 一个自主复制序列(ARS1)； 4. 两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL) ¨保持重组YAC为线状结构； 5. 在两个末端序列中间，有一段填充 序列(His3)¨使pYAC4在细菌细胞中 能稳定扩增； 6. Amp抗性及细菌质粒复制原点； 7. 一个EcoR I 克隆位点，位于酵母菌 Sup4 tRNA基因内。 酵母菌人工染色体pYAC4 在克隆外源DNA时，用Bam HI 和EcoR I双酶切，得到二个人工 染色体臂，与EcoR I 酶切的外源 DNA 片段连接，构成重组的酵母 人工染色体，用于转化酵母菌。5 浙江大学 遗传学第十二章 25 ㈡、λ噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列 为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。中间基因簇可被外源DNA 替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15kb外源DNA片段¨ 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： ♣不易引起生物危害，有助于 “目的”基因进入细胞并增殖； ♣携带大片段外源DNA分子， 占总量25%时仍不失活。 浙江大学 遗传学第十二章 26 ㈢、柯斯质粒(cosmid)： 噬菌体DNA ­ 部分细菌质粒DNA序列 ¨ 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。 这种质粒分子量较小， 但可接受长达50kb的外源 DNA片段¨克隆真核生物 基因。 ∵一个长片段DNA可能 具有真核生物基因的编码 序列及其它调控序列。 浙江大学 遗传学第十二章 27 指能在两种不同生物中复制的载体。 如能在原核生物(如E. coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列 (Auto-nomously replicating sequence, ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、 扩增基因，在酵母重用与基因表达 分析。 酵母菌的YEp (yeast episoma plasmid)等系列载体均是穿梭载体。 ㈣、穿梭载体（shuttle vectors）： 浙江大学 遗传学第十二章 28 ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)： BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子 改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。 特点： 带有外源DNA的BAC载体在 细胞中是单拷贝的； 载体分子量很小(7.4kb)； 选择标记：氯霉素抗性基因； 多克隆位点。 浙江大学 遗传学第十二章 29 ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)： 1996年完成了酵母菌 全基因组序列的测定。 YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受 100~1000kb的外源DNA片段。 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome，HAC) 的研究。 浙江大学 遗传学第十二章 30 pYAC4特点： 1. 两个可在酵母菌中利用的选择基因， URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 2. 酵母菌着丝粒序列(CEN4)； 3. 一个自主复制序列(ARS1)； 4. 两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL) ¨保持重组YAC为线状结构； 5. 在两个末端序列中间，有一段填充 序列(His3)¨使pYAC4在细菌细胞中 能稳定扩增； 6. Amp抗性及细菌质粒复制原点； 7. 一个EcoR I 克隆位点，位于酵母菌 Sup4 tRNA基因内。 酵母菌人工染色体pYAC4 在克隆外源DNA时，用Bam HI 和EcoR I双酶切，得到二个人工 染色体臂，与EcoR I 酶切的外源 DNA 片段连接，构成重组的酵母 人工染色体，用于转化酵母菌