6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumor￾inducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子。6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumor￾inducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子