7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electro￾phoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electro￾phoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物