化活性的降低与Ser22lAla突变相当，Asp32突变成Ala32队酶活性的影响幅度稍微小些， 但酶促活性也只有野生酶的万分之零点五。将这三个位点的氨基酸都变成丙氨酸，突变效果 与His64或Sr221单位，点突变的效果相当。这些结果支持“活性中心是催化三体，尤其是 组氨酸-丝氨酸对联合作用产生活性足够的亲核试剂攻击肽键羰基碳原子”的观，点。尽管这 些位点突变会大大降低酶促反应活性，但是在缓冲液pH值为86时，这些突变体的催化蛋 白水解的速度仍然比没有酶催化的蛋白水解速度快1000倍。 Wild type D32A S221A H64A S221A H64A D32A Uncat. =10 图916枯草杆菌蛋白酶定点突变。催化三体的残基突变成丙氨酸后，测定酶促活性。任一 残基突变都显著降低酶促活性。注意，纵轴是对数轴。突变体命名，第一个字母是野生型酶 的氨基酸缩写，后面的数字表示这个氨基酸所在的氨基酸序列位置，后面一个字母表示该位 点的突变氨基酸。Uncat是没有催化剂的反应效率（估计值）。 定点突变也能研究氧离子洞对催化反应的重要性。AsI55突变成甘氨酸能消除枯草杆 菌氧负离子洞的一个氨基，kcat值降至野生型酶的0.2%，Km值增加两倍。这些结果显示天 冬酰胺的NH基团在稳定羰基碳四面体中间物以及形成该四面体的转化态方面起重要作用。 其他种类的肽水解酶是半胱氨酸、天冬氪酸、和金属蛋白酶 并非所有的蛋白水解酶都使用活化丝氨酸残基，还有其它活活残基水解肽键（图9.17）。 这些蛋白水解酶分别是(1)半胱氨酸蛋白水解酶，(2)天冬氨酸蛋白水解酶，和(3)金 属蛋白水解酶。各种蛋白酶都产生一种亲核试剂，攻击肽键羰基碳原子（图918）。 半胱氨酸蛋白酶的酶促机理与胰凝乳蛋白酶酶促机理最相似。半胱氨酸蛋白酶组氨酸 残基活化的半胱氨酸亲核攻击肽键（图9.18）的方式与丝氨酸蛋白酶丝氨酸颇为相似。研究最 深入的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶(papain)。这个酶是从木瓜分离的。与木瓜蛋白酶同源 的哺乳动物蛋白酶是组织蛋白酶(cathepsins)。组织蛋白酶在免疫系统和其他系统起作用。在 进化过程中，半胱氨酸蛋白酶至少独立出现两次。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，负责细胞 凋亡，但是它们的结构与木瓜蛋白酶没有关系。 天冬氨酸蛋白酶活性位点中心有一对天冬氨酸，它们联合作用活化水分子，后者攻击 肽键。一个天冬氨酸是去质子状态（即解离状态，属于碱催化剂），它攻击水分子使之脱去质 子。另一个天冬氨酸是结合质子的状态（没有解离），使肽键极化导致肽键对亲核攻击敏感 (图9.18)。这类蛋白酶包括肾素。肾素能调解血压和胃蛋白酶(pepsin)活性。天冬氨酸蛋白 酶结构近似二重对称。可能的情况是基因重复产生两考贝基因发生融合，变成编码单一多 肽链的酶。每个考贝基因给活性位点提供一个天冬氨酸。在人免疫缺陷病毒(HV)及其它反 转录病毒中，这两个考贝基因已经融合成编码一条多肽链的基因（图919）。这些结果与酶 早先可能是两个独立亚基的想法一致。化活性的降低与 Ser 221Ala 突变相当，Asp32 突变成 Ala32 队酶活性的影响幅度稍微小些， 但酶促活性也只有野生酶的万分之零点五。将这三个位点的氨基酸都变成丙氨酸，突变效果 与 His64 或 Ser 221 单位点突变的效果相当。这些结果支持“活性中心是催化三体，尤其是 组氨酸-丝氨酸对联合作用产生活性足够的亲核试剂攻击肽键羰基碳原子”的观点。尽管这 些位点突变会大大降低酶促反应活性，但是在缓冲液 pH 值为 8.6 时，这些突变体的催化蛋 白水解的速度仍然比没有酶催化的蛋白水解速度快 1000 倍。 图 9.16 枯草杆菌蛋白酶定点突变。催化三体的残基突变成丙氨酸后，测定酶促活性。任一 残基突变都显著降低酶促活性。注意，纵轴是对数轴。突变体命名，第一个字母是野生型酶 的氨基酸缩写，后面的数字表示这个氨基酸所在的氨基酸序列位置，后面一个字母表示该位 点的突变氨基酸。Uncat 是没有催化剂的反应效率（估计值）。 定点突变也能研究氧离子洞对催化反应的重要性。Asn 155 突变成甘氨酸能消除枯草杆 菌氧负离子洞的一个氨基，kcat 值降至野生型酶的 0.2%，Km 值增加两倍。这些结果显示天 冬酰胺的 NH 基团在稳定羰基碳四面体中间物以及形成该四面体的转化态方面起重要作用。 其他种类的肽水解酶是半胱氨酸、天冬氨酸、和金属蛋白酶 并非所有的蛋白水解酶都使用活化丝氨酸残基，还有其它活活残基水解肽键（图 9.17）。 这些蛋白水解酶分别是（1）半胱氨酸蛋白水解酶，（2）天冬氨酸蛋白水解酶，和（3）金 属蛋白水解酶。各种蛋白酶都产生一种亲核试剂，攻击肽键羰基碳原子（图 9.18）。 半胱氨酸蛋白酶的酶促机理与胰凝乳蛋白酶酶促机理最相似。半胱氨酸蛋白酶组氨酸 残基活化的半胱氨酸亲核攻击肽键(图 9.18)的方式与丝氨酸蛋白酶丝氨酸颇为相似。研究最 深入的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶(papain)。这个酶是从木瓜分离的。与木瓜蛋白酶同源 的哺乳动物蛋白酶是组织蛋白酶(cathepsins)。组织蛋白酶在免疫系统和其他系统起作用。在 进化过程中，半胱氨酸蛋白酶至少独立出现两次。Caspases 也是半胱氨酸蛋白酶，负责细胞 凋亡，但是它们的结构与木瓜蛋白酶没有关系。 天冬氨酸蛋白酶活性位点中心有一对天冬氨酸，它们联合作用活化水分子，后者攻击 肽键。一个天冬氨酸是去质子状态(即解离状态，属于碱催化剂)，它攻击水分子使之脱去质 子。另一个天冬氨酸是结合质子的状态（没有解离），使肽键极化导致肽键对亲核攻击敏感 （图 9.18）。这类蛋白酶包括肾素。肾素能调解血压和胃蛋白酶(pepsin)活性。天冬氨酸蛋白 酶结构近似二重对称。可能的情况是基因重复产生两考贝基因发生融合，变成编码单一多 肽链的酶。每个考贝基因给活性位点提供一个天冬氨酸。在人免疫缺陷病毒(HIV)及其它反 转录病毒中，这两个考贝基因已经融合成编码一条多肽链的基因（图 9.19）。这些结果与酶 早先可能是两个独立亚基的想法一致