、概述 免疫印迹( immunoblotting)又称蛋白质印迹( Western blotting,是一种借 助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术,既具有凝胶电泳的高分辨率又具备固相 免疫测定的高特异性和高灵敏性,可检测1-5ng的中等大小蛋白。其优点是方 法简便、标本可长期保存、结果便于比较,故被广泛应用于分子生物学等领域, 成为一种常用的一种研究方法 在此法中,首先将含有靶蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳( SDS-PAGE)或非变性电泳( Native-PAGE)等分离后,再通过转移电泳原位转印 至硝酸纤维素膜或其它膜的表面,然后再通过抗原抗体反应对膜表面的靶蛋白进 行特异性检测。 、实验方法 免疫印迹的实验程序包括以下5个主要步骤:①样品的制备;②凝胶电泳分 离样品;③电转移;④封闭膜上的非特异性结合部位;⑤靶蛋白的检测。 (一)样品的制备 用于免疫印迹的蛋白样品主要有三个来源:①蛋白溶液;②细胞裂解液;③ 免疫沉淀蛋白。现以如何从细胞中获取蛋白样品为例介绍样品的制备方法。 1.所需试剂 (1)不含DTT的 Lamm样品缓冲液(裂解液):20%SDS,10%甘油 60 mM Tris(pH68),001%溴酚蓝 (2)1MDTT(-20℃冻存); (3)0.01MPBS(pH72)。 2.实验步骤 (1)用适量PBS洗涤细胞两次,弃干净洗液; (2)根据培养细胞的数量加入相应体积的裂解液。通常,每1g细胞(约 109个)加入lnl裂解液,并用细胞刮棒将细胞刮入到离心管中; (3)加入10倍体积的样品缓冲液,强力混匀; (4)最大强度超声4次,每次15~30s,在每次超声间隔期,将样品置于 冰浴中15一、概述 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是一种借 助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术，既具有凝胶电泳的高分辨率又具备固相 免疫测定的高特异性和高灵敏性，可检测 1－5ng 的中等大小蛋白。其优点是方 法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故被广泛应用于分子生物学等领域， 成为一种常用的一种研究方法。 在此法中，首先将含有靶蛋白(抗原)的样品首先用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，再通过转移电泳原位转印 至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后再通过抗原抗体反应对膜表面的靶蛋白进 行特异性检测。 二、实验方法 免疫印迹的实验程序包括以下 5 个主要步骤：①样品的制备；②凝胶电泳分 离样品；③电转移；④封闭膜上的非特异性结合部位；⑤靶蛋白的检测。 （一）样品的制备 用于免疫印迹的蛋白样品主要有三个来源：①蛋白溶液；②细胞裂解液；③ 免疫沉淀蛋白。现以如何从细胞中获取蛋白样品为例介绍样品的制备方法。 1．所需试剂 （1）不含 DTT 的 Laemmli 样品缓冲液（裂解液）：20% SDS，10％甘油， 60mM Tris（pH 6.8），0.01％溴酚蓝； （2）1M DTT（－20℃冻存）； （3）0.01M PBS（pH 7.2）。 2．实验步骤 （1）用适量 PBS 洗涤细胞两次，弃干净洗液； （2）根据培养细胞的数量加入相应体积的裂解液。通常，每 1g 细胞（约 109 个）加入 1ml 裂解液，并用细胞刮棒将细胞刮入到离心管中； （3）加入 10 倍体积的样品缓冲液，强力混匀； （4）最大强度超声 4 次，每次 15～30s，在每次超声间隔期，将样品置于 冰浴中 15s；