轻轻混匀细胞悬液,用振荡器在4℃振荡l5min以裂解细胞。 于4℃,14000g离心裂解液15min,迅速转移上清至另一离心管中,弃 掉沉淀。 5.准备蛋白A(蛋白G或 Sepharose):用PBS洗涤蛋白A(蛋白G或 Sepharose)珠子两次,并将其用PBS调制成50%悬液。 6.每lm细胞裂解液上清加入100μ蛋白A,4℃,振荡10min,进行预清 7.4℃,14000g离心10min移去蛋白A(蛋白G或 Sepharose)珠子,转移 上清至一新离心管中。 8.用 Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白浓度。(应至少将细胞裂 解液作1:10稀释后再测定,这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马 斯亮蓝的作用)。 9.根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度,用PBS将其稀释至1mg/ml以降低 缓冲体系中去污剂的浓度(但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言, l0mgml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些)。 10.加入推荐体积的免疫沉淀抗体至50oμ细胞裂解液中。(抗体的最适用 量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定)。 1.将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h,或置摇床上振荡4℃过夜。(选 择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。)加入100μ蛋白A (蛋白G或 Sepharose)轻轻振荡h或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。(在多 数情况下,加入2g像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的 捕获能力,这对于像小鼠IgG1或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要)。 12.通过脉冲离心(14000rpm,5sy收集琼脂糖/ Sepharose珠子,弃掉上清, 用800u冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。 13.将琼脂糖 Sepharose珠子重悬于60ul2xSDS蛋白上样缓冲液中,轻混 均匀后煮沸5min,200g离心lmin弃掉珠子。 14.将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行 SDS-PAGE电泳。 第四节免疫印迹轻轻混匀细胞悬液，用振荡器在 4℃振荡 15min 以裂解细胞。 4．于 4℃，14000g 离心裂解液 15min，迅速转移上清至另一离心管中，弃 掉沉淀。 5．准备蛋白 A（蛋白 G 或 Sepharose）：用 PBS 洗涤蛋白 A（蛋白 G 或 Sepharose）珠子两次，并将其用 PBS 调制成 50％悬液。 6．每 1ml 细胞裂解液上清加入 100µl 蛋白 A，4℃，振荡 10min，进行预清 除。 7．4℃，14000g 离心 10min 移去蛋白 A（蛋白 G 或 Sepharose）珠子，转移 上清至一新离心管中。 8．用 Bradford 法（考马斯亮蓝染色法）测定蛋白浓度。（应至少将细胞裂 解液作 1：10 稀释后再测定，这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马 斯亮蓝的作用）。 9．根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度，用 PBS 将其稀释至 1mg/ml 以降低 缓冲体系中去污剂的浓度（但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言， 10mg/ml 这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些）。 10．加入推荐体积的免疫沉淀抗体至 500µl 细胞裂解液中。（抗体的最适用 量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定）。 11．将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育 2h，或置摇床上振荡 4℃过夜。（选 择孵育 2h 常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入 100µl 蛋白 A （蛋白 G 或 Sepharose）轻轻振荡 1h 或 4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。（在多 数情况下，加入 2µg 像兔抗小鼠 IgG 这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的 捕获能力，这对于像小鼠 IgG1 或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要）。 12．通过脉冲离心（14000 rpm，5s）收集琼脂糖/Sepharose 珠子，弃掉上清， 用 800µl 冰冷的改良 RIPA 缓冲液洗涤珠子 3 次。 13．将琼脂糖/Sepharose 珠子重悬于 60µl 2×SDS 蛋白上样缓冲液中，轻混 均匀后煮沸 5min，200g 离心 1min 弃掉珠子。 14．将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行 SDS-PAGE 电泳。 第四节 免疫印迹