(一)多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单,可与靶蛋白分子的多个位点结合,所形成的 抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性 结合较多,常会导致反映本底(是否是背景)升高和一定的假阳性结果。 (二)单克隆抗体 与多克隆抗体相比,单克隆抗体往往只结合一种抗原表位,具有单一结合特 异性,所以发生非特异结合的机会少,可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结 构,甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来,单 克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交 叉反应。 、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液,可以是被同位素标记的也可以是未 被标记的。若为前者,免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,只需压片即可检测 到靶蛋白的存在;若为后者,经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后,尚需借助银染 或免疫印迹进行鉴定。 (一)所需试剂及溶液 改良的RPA液(细胞裂解液)、稀释缓冲液(常用PBS溶液)、TSA溶液、 0.05mol/Tris(pH68)、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与 Sepharose或抗免疫球 蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。 改良的RPA液的组成(100ml体系): Iris-HC50mM(pH74)、NP-40:1% 脱氧胆酸钠(0.25%)、NaCl(150mM)、EDIA(1mM)、PMSF(lmM)、抑肽 酶、亮肽酶素、抑肽素(各lμg/nl)、Na3VO4(1mM)、NaF(1mM。 (二)方法 1.用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次,弃干净PBS。(对于悬浮细胞则 用台式离心机以800-1000pm转速通过离心洗涤)。 2.给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液,RIPA液的用量:按照1m/07 细胞/00mm培养面/50cm2瓶或05m每5×106细胞60mm培养面/75cm2瓶 计算 3.用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中,（一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的 抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性 结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特 异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结 构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单 克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交 叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未 被标记的。若为前者，免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，只需压片即可检测 到靶蛋白的存在；若为后者，经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后，尚需借助银染 或免疫印迹进行鉴定。 （一）所需试剂及溶液 改良的 RIPA 液（细胞裂解液）、稀释缓冲液（常用 PBS 溶液）、TSA 溶液、 0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS 蛋白上样缓冲液、抗体与 Sepharose 或抗免疫球 蛋白抗体、蛋白 A、蛋白 G 的交联物。 改良的 RIPA 液的组成（100ml 体系）：Tris-HCl: 50 mM（pH 7.4）、NP-40: 1% 脱氧胆酸钠（0.25%）、NaCl（150 mM）、EDTA（1 mM）、PMSF（1 mM）、抑肽 酶、亮肽酶素、抑肽素（各 1µg /ml）、Na3VO4（1 mM）、NaF（1 mM）。 （二）方法 1．用冰冷的 PBS 溶液洗涤贴壁细胞两次，弃干净 PBS。（对于悬浮细胞则 用台式离心机以 800-1000rpm 转速通过离心洗涤）。 2．给细胞培养瓶中加入冰冷的改良 RIPA 液，RIPA 液的用量：按照 1 ml/107 细胞/100mm 培养面/150cm2 瓶或 0.5 ml 每 5×106 细胞/60mm 培养面/75cm2 瓶 计算。 3．用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中