(5)70℃水浴至少5min (6)1000g离心l0min,取上清液并转移置一新离心管中(若不需立即使 用,可将样品在一20℃稳定保存数月) (二)凝胶电泳 SDS-PAGE是分离蛋白最常用的方法,但其他方法如等电聚焦(IEF)、双向 电泳(IEF和SDS-PAGE)同样可用。在选择电泳方法及电泳条件时应注意以下 几个问题;①凝胶电泳缓冲液一定要与印迹膜的类型相匹配;②上样蛋白总量应 不能使电泳条带发生变形;③分离胶的浓度要与待分离样品的分子量相适应。 SDS-PAGE电泳的方法请参考常规分子生物学实验方法。 (三)电转移 所需试剂 (1)转移缓冲液:39mM甘氨酸,48 mM Tris-HCl,0.037%SDS,20%甲醇 (2)考马斯亮蓝染液 (3)蒸馏水或去离子水 2.实验步骤(半干电转法) (1)用蒸馏水淋洗半干装置的平板电极; (2)将凝胶切成适当大小用于电转,除去无关部分凝胶和未使用的泳道, 做好凝胶标记 (3)剪取6张吸水纸( Whatman3MM或替代品)和一张硝酸纤维素滤膜 (戴手套操作); (4)将硝酸纤维素滤膜浸入蒸馏水中2~5min (5)将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿 (6)将凝胶、硝酸纤维素滤膜、滤纸放在平板装置底部,在检査极性、有 无气泡后接通电源进行转印 (7)转印结束后,给膜作上标记,用考马斯亮蓝对凝胶进行染色以验证转 印的效果。 (四)封闭 1.封闭液5%脱脂奶粉,0.01的防沫剂( antifoam),0.02%叠氮钠溶于 PBS中。（5）70℃水浴至少 5min； （6）10000g 离心 10min，取上清液并转移置一新离心管中（若不需立即使 用，可将样品在－20℃稳定保存数月）。 （二）凝胶电泳 SDS-PAGE 是分离蛋白最常用的方法，但其他方法如等电聚焦（IEF）、双向 电泳（IEF 和 SDS-PAGE）同样可用。在选择电泳方法及电泳条件时应注意以下 几个问题；①凝胶电泳缓冲液一定要与印迹膜的类型相匹配；②上样蛋白总量应 不能使电泳条带发生变形；③分离胶的浓度要与待分离样品的分子量相适应。 SDS-PAGE 电泳的方法请参考常规分子生物学实验方法。 （三）电转移 1．所需试剂 （1）转移缓冲液：39mM 甘氨酸，48mM Tris-HCl, 0.037％SDS，20％甲醇； （2）考马斯亮蓝染液； （3）蒸馏水或去离子水。 2．实验步骤（半干电转法） （1）用蒸馏水淋洗半干装置的平板电极； （2）将凝胶切成适当大小用于电转，除去无关部分凝胶和未使用的泳道， 做好凝胶标记； （3）剪取 6 张吸水纸（Whatman 3MM 或替代品）和一张硝酸纤维素滤膜 （戴手套操作）； （4）将硝酸纤维素滤膜浸入蒸馏水中 2～5min； （5）将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿； （6）将凝胶、硝酸纤维素滤膜、滤纸放在平板装置底部，在检查极性、有 无气泡后接通电源进行转印； （7）转印结束后，给膜作上标记，用考马斯亮蓝对凝胶进行染色以验证转 印的效果。 （四）封闭 1．封闭液 5％脱脂奶粉，0.01 的防沫剂（antifoam），0.02％叠氮钠溶于 PBS 中