2.实验步骤 (1)将硝酸纤维素滤膜放在一张干净的滤纸上,室温干燥30~60min (2)将硝酸纤维素滤膜转移至一平皿中,加入可以浸末滤膜量的封闭液室 温振荡1~3h (五)抗原抗体反应检测靶蛋白 免疫印迹试验中对靶蛋白的检测既可以采用直接法,也可以采用间接法。用 标记的一抗直接检测的优点在于:膜的背景较低、简单、快捷,并且减少了交叉 反应的机会,但其灵敏度明显低于间接法。除非在特殊情况下使用直接法,通常 免疫印迹均采用间接法:一抗通常未标记,而是借助二抗的酶标记进行放大显色, 借以显示靶蛋白 所需试剂 (1)一抗的稀释(用封闭液) 多克隆抗体:1:100-1:5000 杂交瘤细胞培养上清:不作稀释或1:100 荷瘤小鼠腹水:1:1000-1:10000 (2)漂洗液I:0.01MPBS(pH7.2) (3)漂洗液I:150 ImMNaCl,50 mM Tris-HCI(pH75) (4)封闭液:同前 2.实验步骤 (1)从封闭液中将膜取出,用PBS冲洗两次,每次5min (2)加入抗体,抗体用量为10ml/15×15cm2膜,0.5ml/15×0.5cm2膜,置 塑料袋中封存。抗体在使用前已经封闭液稀释 (3)室温下轻轻振荡孵育1h; (4)漂洗液I洗涤1次,10min (5)将膜转移到另一塑料袋中,加入标记好的且经封闭液稀释的二抗,抗 体用量同第2步; (6)室温下轻轻振荡孵育1~2h (⑦)取出滤膜,用大量漂洗液Ⅱ洗涤3~5次,每次10min,以除去未结合 之二抗2．实验步骤 （1）将硝酸纤维素滤膜放在一张干净的滤纸上，室温干燥 30～60min； （2）将硝酸纤维素滤膜转移至一平皿中，加入可以浸末滤膜量的封闭液室 温振荡 1～3h。 （五）抗原抗体反应检测靶蛋白 免疫印迹试验中对靶蛋白的检测既可以采用直接法，也可以采用间接法。用 标记的一抗直接检测的优点在于：膜的背景较低、简单、快捷，并且减少了交叉 反应的机会，但其灵敏度明显低于间接法。除非在特殊情况下使用直接法，通常 免疫印迹均采用间接法：一抗通常未标记，而是借助二抗的酶标记进行放大显色， 借以显示靶蛋白。 1．所需试剂 （1）一抗的稀释（用封闭液） 多克隆抗体：1:100－1:5000 杂交瘤细胞培养上清：不作稀释或 1:100 荷瘤小鼠腹水：1:1000－1:10000 （2）漂洗液 I：0.01M PBS(pH7.2) （3）漂洗液 II：150mM NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.5) （4）封闭液：同前。 2．实验步骤 （1）从封闭液中将膜取出，用 PBS 冲洗两次，每次 5min； （2）加入抗体，抗体用量为 10ml／15×15cm2 膜，0.5ml／15×0.5cm2 膜，置 一塑料袋中封存。抗体在使用前已经封闭液稀释； （3）室温下轻轻振荡孵育 1h； （4）漂洗液 I 洗涤 1 次，10min； （5）将膜转移到另一塑料袋中，加入标记好的且经封闭液稀释的二抗，抗 体用量同第 2 步； （6）室温下轻轻振荡孵育 1～2h。 （7）取出滤膜，用大量漂洗液 II 洗涤 3～5 次，每次 10min，以除去未结合 之二抗