第四章单克隆杭体 2。体内培养 将2×10？杂交瘤细胞悬浮于2 mlPBS或生理盐水，腹腔注射预先以2ml降植烷或不完 全佐剂或两者等体积混合物处理的大鼠。10天左右即产生腹水，平均每只大鼠可收获50 腹水。若在大鼠状态良好时，小心分次抽取还可能获得更多的腹水。作为诱生腹水的动物选 用80周龄的健康大鼠为宜，老龄鼠不易成功且产生的腹水量也低于适龄大鼠。 第四节兔单克隆抗体的制备 自上世纪七十年代末鼠单克隆抗体技术发明以来，人们就梦想通过兔制备单克隆抗体， 因为兔的脾脏比小鼠的脾脏大，同时从进化角度讲兔人类的进化距离要比小鼠人类的远， 因此使用人类蛋自作为免疫原时，免比小鼠可能获得更强的免疫反应。由于建立免杂交宿细 胞存在许多技术难关，直到在995年Katherine Knight博士获得永久的兔杂交瘤细胞系之 前没有人能获得成功。I9g5年，Dr.Katherine Knight在Loyola University of Chicago成功地 在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿痼(plasmacytoma)。其后几年里，Dr:Robert Pytela和Mr Weimin Zhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。从目前获 得的兔单克隆抗体的结果来看，兔单克隆抗体比鼠单克降抗体具有更高的亲合力（大约10 倍左右)。研究表明，兔的免疫系统能够对小鼠不能识别的小的抗原决定簇产生亲合力，角 单克隆抗体能够识别许多在鼠中不能产生免疫反应的抗原。美国Epitomics公司已获得了生 产兔单克隆杂交的独家专利使用权。 兔单克隆抗体的大体生产过程与常见的鼠单克降抗体类似。包括免疫、融合、筛选、建 株及扩大培养。一般制备兔单克隆抗体的周期需要5-8个月，包括免疫23个月，抗血清的 分析检测大概要12周。融合后需要4-6周的时间进行杂交瘤细胞的生长、初筛，然后把状 态好的细胞转移至24孔板中。选择预期想要获得的克隆后，需要34周的时间进行亚克隆 和进一步的筛选。亚克隆扩展培养和小规模gG生产(5-20mg)需要6-8周。 免疫和筛选所需蛋白的量相对较多（初次免疫为每只兔子300μg,强化免疫为每只 100-200μg),总计至少需要3mg蛋白来免疫2只兔子和完成ELISA检测。但是，某些情况 下很难获得这个量。免疫效果取决于蛋白免疫原性，有时很少的蛋白量也能诱导很好的免疫 反应（有些每次只需要10g)。在小腿注射，从腿弯部淋巴结收集细胞都是减少免疫原用量 的方法。 兔单克隆抗体与其他抗体有相同的应用领域。兔单克隆抗体已经成功地应用于免疫印 迹、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫沉淀和流式细胞术。最近兔单克隆抗体己经获准诊 断应用。 第五节单克隆抗体的应用 Kohler和Milstein于1975年发明了被称之为“宽弹“的单克降抗体技术以来，单克隆抗 体由于其无可比拟的优越性，被广泛应用于生物医学的各个领域。单克隆抗体是由B淋巴 -69 第四章 单克隆抗体 - 69 - 2．体内培养 将 l~2×10 7杂交瘤细胞悬浮于 2mlPBS 或生理盐水，腹腔注射预先以 2ml 降植烷或不完 全佐剂或两者等体积混合物处理的大鼠。10 天左右即产生腹水，平均每只大鼠可收获 50ml 腹水。若在大鼠状态良好时，小心分次抽取还可能获得更多的腹水。作为诱生腹水的动物选 用 8~10 周龄的健康大鼠为宜，老龄鼠不易成功且产生的腹水量也低于适龄大鼠。 第四节 兔单克隆抗体的制备 自上世纪七十年代末鼠单克隆抗体技术发明以来，人们就梦想通过兔制备单克隆抗体， 因为兔的脾脏比小鼠的脾脏大，同时从进化角度讲兔-人类的进化距离要比小鼠-人类的远， 因此使用人类蛋白作为免疫原时，兔比小鼠可能获得更强的免疫反应。由于建立兔杂交瘤细 胞存在许多技术难关，直到在 1995 年 Katherine Knight 博士获得永久的兔杂交瘤细胞系之 前没有人能获得成功。1995 年，Dr. Katherine Knight 在 Loyola University of Chicago 成功地 在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几年里，Dr. Robert Pytela 和 Mr. Weimin Zhu 在 UCSF 将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。从目前获 得的兔单克隆抗体的结果来看，兔单克隆抗体比鼠单克隆抗体具有更高的亲合力（大约 10 倍左右）。研究表明，兔的免疫系统能够对小鼠不能识别的小的抗原决定簇产生亲合力，兔 单克隆抗体能够识别许多在鼠中不能产生免疫反应的抗原。美国 Epitomics 公司已获得了生 产兔单克隆杂交瘤的独家专利使用权。 兔单克隆抗体的大体生产过程与常见的鼠单克隆抗体类似。包括免疫、融合、筛选、建 株及扩大培养。一般制备兔单克隆抗体的周期需要 5-8 个月，包括免疫 2-3 个月，抗血清的 分析检测大概要 1-2 周。融合后需要 4-6 周的时间进行杂交瘤细胞的生长、初筛，然后把状 态好的细胞转移至 24 孔板中。选择预期想要获得的克隆后，需要 3-4 周的时间进行亚克隆 和进一步的筛选。亚克隆扩展培养和小规模 IgG 生产（5-20mg）需要 6-8 周。 免疫和筛选所需蛋白的量相对较多（初次免疫为每只兔子 300µg,强化免疫为每只 100-200µg），总计至少需要 3mg 蛋白来免疫 2 只兔子和完成 ELISA 检测。但是，某些情况 下很难获得这个量。免疫效果取决于蛋白免疫原性，有时很少的蛋白量也能诱导很好的免疫 反应（有些每次只需要 10µg）。在小腿注射，从腿弯部淋巴结收集细胞都是减少免疫原用量 的方法。 兔单克隆抗体与其他抗体有相同的应用领域。兔单克隆抗体已经成功地应用于免疫印 迹、免疫细胞化学、免疫组织化学、免疫沉淀和流式细胞术。最近兔单克隆抗体已经获准诊 断应用。 第五节 单克隆抗体的应用 Kohler 和 Milstein 于 1975 年发明了被称之为“魔弹”的单克隆抗体技术以来，单克隆抗 体由于其无可比拟的优越性，被广泛应用于生物医学的各个领域。单克隆抗体是由 B 淋巴