第四章单克隆杭保 仅在LOUC大鼠体内可以传代，而且可以在体外培养。为了便于杂交瘤细胞在动物体内诱 生腹水，融合用的免疫脾细胞最好来自LU大鼠 983细胞培养于含10%牛血清的DMEM完全培养液中。其形态椭圆或多边形，不像 SP20那样呈规则的圆形。半贴壁生长，其生长增殖具有明显的浓度依赖性，每次传代时细 胞浓度不能低于10ml。融合前1周（至少3天）要调整细胞浓度，以保证其最佳的生长状 态。培养应隔天换液，保持细胞数为10ml,若细胞浓度为2×10ml即需要每天换液。要 其倍增时间不超过16h,细胞活力达90%。 影响融合成功的因素很多，关键是983细胞的生长状态，其次为小牛血清的质量及是否 有支原体污染等。细胞清除支原体污染的方法：收集所有污染的细胞，离心弃上请，再悬浮 于0.5ml生理盐水中，注入L0U大鼠前肢的腋下部皮下。 (二)免疫 一般采用的免疫程序如下：第一次免疫以细胞为抗原(10细胞/只大鼠)不用佐剂，腹 腔注射。若用可溶性抗原，100ug0.30.5m/只，加等体积的完全福氏佐剂，充分乳化，经 足垫、皮下多点免疫或经腹腔注射。间隔23周后以同样的方法进行第二次免疫。因不同动 物个体反应性有很大差异，尽可能多免疫几只大鼠，另外，最好取血测效价，根据效价选取 动物备融合用。使动物间歇至少1个月或2~3个月后加强免疫，细胞量为2~5×10只，腹 腔注射：可溶性抗原100-500ug只，尾静脉注射。加强免疫后第4天融合。可溶性抗原也 可连续加强免疫3次，每次100即g,最后1次加强免疫的次日取脾融合。为争取时间或特殊 需要也可采用短期快速的免疫程序，每隔3天免疫1次，连续免疫3次或4次，末次免疫 34后融合：或1次脾内免疫后融合也有获得成功的例子。融合的技术方法及试剂同小鼠 体系。 (白)饰选及克隆 对大骨髓细胞的选择培养液同小鼠的SP20,HAT及HT为选择性培养基。大鼠杂 交瘤细胞所形成的集落有的比较分散，不像小鼠杂交瘤细胞形成的集落那样密集。对有杂交 瘤生长孔的培养上清进行筛选，可采用ELIS或微孔免疫细胞化学染色法。大鼠检测体系 使用酶标记小鼠抗大鼠链(MARK-I),最后以OPD-HO2或DAB-HO2底物显色，也可用 Biotin标记MARK-小、Strapavidin标记HRP,再以底物显色。因大鼠的单抗95%为x链，因 此，不论哪种Ig亚类均可用MARK-筛选，不致漏筛， 当筛选到阳性反应孔时应尽早进行克隆化，以免不分泌的无效细胞与分泌抗体的杂交瘤 细胞竞争生长。克隆的方法有多种，比较简便易行常用的方法是有限稀释法。 (四)单克隆抗体的制备 1.体外培养 将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞置于培养瓶中，2×105细胞ml×50ml或根据培养瓶大小 增加或减少培养液体积，但要保持同样的细胞浓度。培养2周，转瓶效果比静止培养好。有 实验证明培养2周时，单抗含量达到峰坪区，约20-50ugml左右。 -68-第四章 单克隆抗体 - 68 - 仅在 LOU/C 大鼠体内可以传代，而且可以在体外培养。为了便于杂交瘤细胞在动物体内诱 生腹水，融合用的免疫脾细胞最好来自 LOU 大鼠。 983 细胞培养于含 10％牛血清的 DMEM 完全培养液中。其形态椭圆或多边形，不像 SP2/0 那样呈规则的圆形。半贴壁生长，其生长增殖具有明显的浓度依赖性，每次传代时细 胞浓度不能低于 10 5 /ml。融合前 1 周（至少 3 天）要调整细胞浓度，以保证其最佳的生长状 态。培养应隔天换液，保持细胞数为 10 5 /ml，若细胞浓度为 2×10 5 /ml 即需要每天换液。要 其倍增时间不超过 16h，细胞活力达 90％。 影响融合成功的因素很多，关键是 983 细胞的生长状态，其次为小牛血清的质量及是否 有支原体污染等。细胞清除支原体污染的方法：收集所有污染的细胞，离心弃上请，再悬浮 于 0.5ml 生理盐水中，注入 LOU 大鼠前肢的腋下部皮下。 (二) 免疫 一般采用的免疫程序如下：第一次免疫以细胞为抗原（10 7细胞/只大鼠）不用佐剂，腹 腔注射。若用可溶性抗原，100μg/0.3~0.5ml/只，加等体积的完全福氏佐剂，充分乳化，经 足垫、皮下多点免疫或经腹腔注射。间隔 2~3 周后以同样的方法进行第二次免疫。因不同动 物个体反应性有很大差异，尽可能多免疫几只大鼠，另外，最好取血测效价，根据效价选取 动物备融合用。使动物间歇至少 1 个月或 2~3 个月后加强免疫，细胞量为 2~5×10 7 /只，腹 腔注射；可溶性抗原 100~500μg/只，尾静脉注射。加强免疫后第 4 天融合。可溶性抗原也 可连续加强免疫 3 次，每次 100pg，最后 1 次加强免疫的次日取脾融合。为争取时间或特殊 需要也可采用短期快速的免疫程序，每隔 3 天免疫 1 次，连续免疫 3 次或 4 次，末次免疫 3~4d 后融合；或 1 次脾内免疫后融合也有获得成功的例子。融合的技术方法及试剂同小鼠 体系。 (三) 筛选及克隆 对大鼠骨髓瘤细胞的选择培养液同小鼠的 SP2/0，HAT 及 HT 为选择性培养基。大鼠杂 交瘤细胞所形成的集落有的比较分散，不像小鼠杂交瘤细胞形成的集落那样密集。对有杂交 瘤生长孔的培养上清进行筛选，可采用 ELISA 或微孔免疫细胞化学染色法。大鼠检测体系 使用酶标记小鼠抗大鼠κ链（MARK-l），最后以 OPD-H2O2或 DAB-H2O2底物显色，也可用 Biotin 标记 MARK-l、Strapavidin 标记 HRP，再以底物显色。因大鼠的单抗 95％为κ链，因 此，不论哪种 Ig 亚类均可用 MARK-筛选，不致漏筛。 当筛选到阳性反应孔时应尽早进行克隆化，以免不分泌的无效细胞与分泌抗体的杂交瘤 细胞竞争生长。克隆的方法有多种，比较简便易行常用的方法是有限稀释法。 (四) 单克隆抗体的制备 1．体外培养 将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞置于培养瓶中，2×10 5细胞/ml×50ml 或根据培养瓶大小 增加或减少培养液体积，但要保持同样的细胞浓度。培养 2 周，转瓶效果比静止培养好。有 实验证明培养 2 周时，单抗含量达到峰坪区，约 20~50μg/ml 左右