第四章单克隆杭保 免骨髓瘤细胞本身g轻重链的干扰，以便获得更纯一的抗体，最好选用自身不合成免疫球 蛋白轻重链的骨髓疝细胞。目前常用SP2/0-Ag14作为亲本细胞与脾细胞融合。 2.融合前骨髓瘤细胞的准备 融合前一周用完全培养液扩增SP20-Ag14骨髓疝细胞，到融合的当天，必须得到以下 数目的骨髓瘤细胞：与小鼠脾细胞融合约需1x10个骨随瘤细胞：与仓鼠脾细胞融合约周 2x103个骨髓瘤细胞：与大鼠脾融合约需5~10x103个骨髓瘤细胞。融合前一天，用新鲜培养 基将细胞传代。 注意：用于细胞融合的骨骑离细胞，必须处在对数生长期，细胞形态要规则，机能要活 跃，活细胞数在90%一95%以上。细胞不能生长过度，培养基不应变浊（黄色）。骨髓瘤细 胞偶尔会“回复”成能在HAT培养液中生长的细胞，这种情况下，可用含有诱导剂8-氨杂鸟 嘌吟(20ugml)或6-巯基鸟嘌吟(40ug/ml)的完全DMEM培养基进行培养。 (三)脾细胞悬液的制备 1.动物加强免疫融合前3天进行加强免疫，方法见前。 2.无菌取出动物脾脏。注意：不要用麻醉剂处死动物。小鼠可拉颈处死，C0室息可 用于小鼠、仓鼠和大鼠，这样可以防止麻醉剂通过血液而进入培养系统。 3.将脾脏放入直径10cm、盛有10ml无血清培养基的平皿中。 4.用小弯镊子剥去脾脏外的脂肪及结缔组织，将脾置于圆形不锈钢丝网上，用剪刀剪 碎，再用注射器针芯挤压，使脾细胞通过网眼成为单细胞悬液。 5.脾细胞悬液移入50ml离心管，加满无血清培养基，500×g室温离心5min,弃去上 清。 注：不要使用含有PEG、蛋白和HEPES的培养基，PEG会沉淀蛋白，而HEPES在融 合时对细胞有毒性。 6。用5 I NHC1溶液重悬细胞，室温放置5min以溶解红细胞。 7.加入45ml无血清DMEM培养液，500g室温离心5min,弃上清。 8.每次用50ml无血清DMEM培养液离心洗涤两次。 9.洗涤脾细胞同时，将骨髓瘤细胞移入50ml离心管，离心洗涤3次。 10.分别用1Oml无血清DMEM培养液重悬脾细胞和骨髓瘤细胞，计算细胞数量并用 台盼蓝或伊红染色计数活细胞比例。两种细胞的活细胞比例均应接近100%。 IL.根据两种细胞的总数，计算按2.5x10ml重悬细胞所用完全DMEM/HEPES培养 基的量，将这一体积的培养基预温于37℃。 (四)融合细胞 1.按细胞数1：1的比例将SP20-Ag14细胞和脾细胞混合于50ml离心管中，加满无血 清DMEM培养液。 注：细胞比例要求不是很严，骨髓瘤细胞和脾细胞的比例降至1：20也有成功融合的报 道。 2.500×g室温离心5min.弃去上清，尽可能除干净液体 -58第四章 单克隆抗体 - 58 - 免骨髓瘤细胞本身 Ig 轻重链的干扰，以便获得更纯一的抗体，最好选用自身不合成免疫球 蛋白轻重链的骨髓瘤细胞。目前常用 SP2/0-Ag14 作为亲本细胞与脾细胞融合。 2． 融合前骨髓瘤细胞的准备 融合前一周用完全培养液扩增 SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞，到融合的当天，必须得到以下 数目的骨髓瘤细胞：与小鼠脾细胞融合约需 1×10 8 个骨髓瘤细胞；与仓鼠脾细胞融合约需 2×10 8个骨髓瘤细胞；与大鼠脾融合约需 5~10×10 8个骨髓瘤细胞。融合前一天，用新鲜培养 基将细胞传代。 注意：用于细胞融合的骨髓瘤细胞，必须处在对数生长期，细胞形态要规则，机能要活 跃，活细胞数在 90％～95％以上。细胞不能生长过度，培养基不应变浊（黄色）。骨髓瘤细 胞偶尔会“回复”成能在 HAT 培养液中生长的细胞，这种情况下，可用含有诱导剂 8-氮杂鸟 嘌呤（20μg/ml）或 6-巯基鸟嘌呤（40μg/ml）的完全 DMEM 培养基进行培养。 （三）脾细胞悬液的制备 1．动物加强免疫 融合前 3 天进行加强免疫，方法见前。 2．无菌取出动物脾脏。注意：不要用麻醉剂处死动物。小鼠可拉颈处死，CO2窒息可 用于小鼠、仓鼠和大鼠，这样可以防止麻醉剂通过血液而进入培养系统。 3．将脾脏放入直径 10cm、盛有 10ml 无血清培养基的平皿中。 4．用小弯镊子剥去脾脏外的脂肪及结缔组织，将脾置于圆形不锈钢丝网上，用剪刀剪 碎，再用注射器针芯挤压，使脾细胞通过网眼成为单细胞悬液。 5．脾细胞悬液移入 50ml 离心管，加满无血清培养基，500×g 室温离心 5min，弃去上 清。 注：不要使用含有 PEG、蛋白和 HEPES 的培养基，PEG 会沉淀蛋白，而 HEPES 在融 合时对细胞有毒性。 6．用 5ml NH4C1 溶液重悬细胞，室温放置 5min 以溶解红细胞。 7．加入 45ml 无血清 DMEM 培养液，500g 室温离心 5min，弃上清。 8．每次用 50ml 无血清 DMEM 培养液离心洗涤两次。 9．洗涤脾细胞同时，将骨髓瘤细胞移入 50ml 离心管，离心洗涤 3 次。 10．分别用 10ml 无血清 DMEM 培养液重悬脾细胞和骨髓瘤细胞，计算细胞数量并用 台盼蓝或伊红染色计数活细胞比例。两种细胞的活细胞比例均应接近 100％。 11．根据两种细胞的总数，计算按 2.5×10 6 /ml 重悬细胞所用完全 DMEM/ HEPES 培养 基的量，将这一体积的培养基预温于 37℃。 (四) 融合细胞 1．按细胞数 1：1 的比例将 SP2/0-Ag14 细胞和脾细胞混合于 50ml 离心管中，加满无血 清 DMEM 培养液。 注：细胞比例要求不是很严，骨髓瘤细胞和脾细胞的比例降至 1：20 也有成功融合的报 道。 2．500×g 室温离心 5min，弃去上清，尽可能除干净液体