第四章单克隆杭体 3.用手指叩击离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水浴。 4.将在37℃水浴中保温的50%的PEG1ml用滴管一滴滴加入离心管中，在37℃水浴 中边滴边摇动离心管，使细胞保持在混匀状态，1分钟滴完。 5,加完PEG后，继续在37C水浴中摇动离心管1min。 注：随者PEG处理时间的增加，融合率和细胞毒性都增加，低浓度(30一35%)PEG 可以使用较长时间（如7min),50%pEG处理不超过12min: 6.用新的滴管，将1ml37℃水浴预温的无血清培养基一滴滴加入离心管，同时轻轻晃 动离心管，一分钟加完。相同方法再加入1ml无血清DMEM。 注：稀释PEG很关键，动作要轻柔，否则会减少杂交瘤细胞的收率。 7.用10ml滴管将7ml预温的无血清培养基一滴滴加入离心管，2~3分钟加完，这时 镜下观察细胞应有明显聚团现象。 8.室温500×g离心5min。弃去上清，离心管置于水浴中。 注：细胞融合后跪性大，应将离心洗涤和重悬的步聚减到最少。 9.加入预温的完全培养液（含20%FCS)。 10.用10ml滴管轻轻吸出细胞悬液，按每孔2滴（约100125u/孔）加入到96孔平底 培养板。37℃、5%C02培养箱中培养过夜。注意：新形成的杂交瘤细胞还不稳定，这一步 应避免用滴管吸打细胞，将细胞悬液加入96孔板时也应动作轻柔。操作时，手不要置于培 养板上方，以防污染。重新吸取细胞悬液时，应换用新的滴管。为防止成纤维细胞过度生长 可以将融合后的细胞悬液放入培养瓶中贴壁过夜，然后再种入96孔板。 很多研究者将杂交瘤接种入大的容器，如24孔培养板，每孔含有更多的细胞。这样以 后的换液就变得容易，但也会使每孔中含有多个杂交细胞，一些生长快的杂交细胞可能会掩 盖一些生长慢的杂交细胞。 11.培养一天后，用相差显微镜检查细胞。如果接种的细胞数目合适，板底应该有接近 连成单层的细胞和一些明显的细胞团。 12.用10ml滴管每孔加入2滴HAT培养基，放入培养箱维续培养。 注：每块96孔板要用不同的滴管，使每块板都相对独立，以防可能出现的污染扩散。 如果出现了污染，最好将污染的96孔板弃掉。 13.在第2、3、4、5、7、9和11天，用吸管斜靠在培养孔口，小心地每孔吸去12体 积的培养液，再换入12体积的HAT培养液（半量换液），96孔板放入培养箱培养。注意： 注意每板换用新的吸管。 因为杂交瘤的成功率<105，当加入HT培养基2~3天后，就会出现细胞大量死亡，直 至杂交瘤细胞扩增后才会再见到活细胞。在小鼠小鼠融合的第？~9天、大鼠小鼠融合的第 11天、仓鼠一小鼠融合的第14天，相差显微镜下就可以见到成簇的杂交瘤细胞。 除了前4天外，细胞的换液可根据实际情况而定，如每孔实际细胞密度、融合的效率、 杂交瘤的出现时间和生长状况等。应每天查看培养板，不要使培养基变黄的时间超过一天。 14.在第14天，按上一步的方法用HT培养基给细胞换液。 注：不必用T培养液多次换液，经过这一次换液后氨基噪吟已被稀释，细胞不需再添 加HT就可存活。 -59 第四章 单克隆抗体 - 59 - 3．用手指叩击离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置 37℃水浴。 4．将在 37℃水浴中保温的 50%的 PEG 1ml 用滴管一滴滴加入离心管中，在 37℃水浴 中边滴边摇动离心管，使细胞保持在混匀状态，1 分钟滴完。 5．加完 PEG 后，继续在 37℃水浴中摇动离心管 1min。 注：随着 PEG 处理时间的增加，融合率和细胞毒性都增加，低浓度（30～35％）PEG 可以使用较长时间（如 7min），50％PEG 处理不超过 1～2min。 6．用新的滴管，将 l ml 37℃水浴预温的无血清培养基一滴滴加入离心管，同时轻轻晃 动离心管，一分钟加完。相同方法再加入 l ml 无血清 DMEM。 注：稀释 PEG 很关键，动作要轻柔，否则会减少杂交瘤细胞的收率。 7．用 10ml 滴管将 7ml 预温的无血清培养基一滴滴加入离心管，2～3 分钟加完，这时 镜下观察细胞应有明显聚团现象。 8．室温 500×g 离心 5min。弃去上清，离心管置于水浴中。 注：细胞融合后脆性大，应将离心洗涤和重悬的步骤减到最少。 9．加入预温的完全培养液（含 20％FCS）。 10．用 10ml 滴管轻轻吸出细胞悬液，按每孔 2 滴（约 100~125μl/孔）加入到 96 孔平底 培养板。37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。注意：新形成的杂交瘤细胞还不稳定，这一步 应避免用滴管吸打细胞，将细胞悬液加入 96 孔板时也应动作轻柔。操作时，手不要置于培 养板上方，以防污染。重新吸取细胞悬液时，应换用新的滴管。为防止成纤维细胞过度生长， 可以将融合后的细胞悬液放入培养瓶中贴壁过夜，然后再种入 96 孔板。 很多研究者将杂交瘤接种入大的容器，如 24 孔培养板，每孔含有更多的细胞。这样以 后的换液就变得容易，但也会使每孔中含有多个杂交细胞，一些生长快的杂交细胞可能会掩 盖一些生长慢的杂交细胞。 11．培养一天后，用相差显微镜检查细胞。如果接种的细胞数目合适，板底应该有接近 连成单层的细胞和一些明显的细胞团。 12．用 10ml 滴管每孔加入 2 滴 HAT 培养基，放入培养箱继续培养。 注：每块 96 孔板要用不同的滴管，使每块板都相对独立，以防可能出现的污染扩散。 如果出现了污染，最好将污染的 96 孔板弃掉。 13．在第 2、3、4、5、7、9 和 11 天，用吸管斜靠在培养孔口，小心地每孔吸去 1/2 体 积的培养液，再换入 1/2 体积的 HAT 培养液（半量换液），96 孔板放入培养箱培养。注意： 注意每板换用新的吸管。 因为杂交瘤的成功率≤10 -5，当加入 HAT 培养基 2～3 天后，就会出现细胞大量死亡，直 至杂交瘤细胞扩增后才会再见到活细胞。在小鼠-小鼠融合的第 7~9 天、大鼠-小鼠融合的第 11 天、仓鼠一小鼠融合的第 14 天，相差显微镜下就可以见到成簇的杂交瘤细胞。 除了前 4 天外，细胞的换液可根据实际情况而定，如每孔实际细胞密度、融合的效率、 杂交瘤的出现时间和生长状况等。应每天查看培养板，不要使培养基变黄的时间超过一天。 14．在第 14 天，按上一步的方法用 HT 培养基给细胞换液。 注：不必用 HT 培养液多次换液，经过这一次换液后氨基喋呤已被稀释，细胞不需再添 加 HT 就可存活