第四章单克隆杭保 15.在第15天之后，用不含HAT或HT的完全DMEM/HEPES培养基给细胞换液。当 大多数有细胞生长的孔达到10%~25%满时，就可以准条筛洗了。 注：如果筛选中要用3HTR掺入实验时，注意HAT或HT培养基中大量的胸腺嘧啶 核苷会抑制3H-TdR的掺入，应预先用不含HAT或HT的培养基换液3~4次。 三、杂交瘤细胞的筛选 两种细胞的随机融合可产生3种融合细胞，加上非融合的2种亲本细胞，在融合后的培 养体系中有5种细胞，融合细胞所占比例极小。B淋巴细胞因不能在体外长期培养，故易于 消除，但骨髓瘤细胞及骨随瘤与骨髓瘤融合的细胞，其增殖能力较杂交融合细胞强得多，因 此，如何在融合后快速筛选杂交细胞是单克隆抗体技术的关键，筛选方法必须在进行细胞融 合之前确定下来。 HAT筛选培养液是根据次黄嘌吟核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。细胞DNA 生物合成有两条途径，一条是主要途径，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而 合成DNA。在这条合成途径中叶酸衍生物是必不可少的中间体，它参与嘌吟环和胸腺嘧啶 甲基的生物合成。甲氨喋吟是一种叶酸拈抗剂，可以阻断DNA生物合成的主要途径，在 HAT选择培养基中含有甲氨喋吟，因此在HAT培养液中细胞的DNA合成主要途径被阻断， 需要利用另一条途径，即补救途径来合成DNA。利用补救途径合成DNA需依赖次黄吟 胸腺嘧啶脱氧核苷等DNA前体的存在，而且细胞内要有次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶和 胸腺嘧啶核苷激酶(hymidine kinases,.TK),若缺乏其中一种醇，该补救途径便不能发挥作 用。 Littlefield用两种突变细胞株，一种缺失TK酶，但保留HGPRT酶，另一种则正相反 缺失HGPRT酶，而保留TK酶，在通常培养条件下，因为细胞可利用叶酸(folio acid)经 主要合成途径合成DNA,所以这些酶的缺失对细胞生存并无影响。只有当主要合成途径被 甲氨喋吟封闭时，具有酶缺失的这些细胞便不能存活。若将这两种细胞融合，只有杂交箱细 胞能在HAT培养液中生存。因为一种亲代细胞补充了另一种亲代细胞的酶缺失，因此杂交 瘤细胞能在筛选培养液中存活。没有融合的亲代细胞，或相同亲代细胞融合产生的同核体则 不能存活，因为他们仍然缺失TK薛或HGPRT酶。 一般而言，使骨髓瘤细胞突变，并筛选出HGRT旅缺失的细胞较TK酶缺失的细胞更 容易一些。在正常情况下，每个细胞的X染色体只有一个活性拷贝，所以在理论上单个突 变即可产生HGPRT醇缺失的突变体.为了获得这种突变体，常用的方法是用浓度为20ugml 的8-杂氨鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤诱导骨髓瘤细胞使其成为HGPRT酶缺失的突变体。这是由 于HGPRT酶的特异性差，在嘌吟核苷酸的补救途径中也可以将嘌吟类似物8-杂氮鸟嘌吟或 6硫代鸟嘌吟掺入到DNA中，引起细胞死亡。逐步提高这些药物的浓度可使所有具有 HGPRT酶的细胞都死亡，只有缺失该酶的突变细胞能存活。缺乏HGPRT酶或TK酶的细胞 同时失去了DNA合成的补救途径，也就获得了对HAT的敏感性。 突变株骨随瘤细胞与髀细胞融合后，脾脏B细胞的HGPRT酶提供了DNA合成的补救 途径，所以杂交产生的异核体可在HAT中存活增殖，并产生均一的、具有特异性的抗体， -60第四章 单克隆抗体 - 60 - 15．在第 15 天之后，用不含 HAT 或 HT 的完全 DMEM/HEPES 培养基给细胞换液。当 大多数有细胞生长的孔达到 10％～25％满时，就可以准备筛选了。 注：如果筛选中要用 3H-TdR 掺入实验时，注意 HAT 或 HT 培养基中大量的胸腺嘧啶 核苷会抑制 3H-TdR 的掺入，应预先用不含 HAT 或 HT 的培养基换液 3～4 次。 三、杂交瘤细胞的筛选 两种细胞的随机融合可产生 3 种融合细胞，加上非融合的 2 种亲本细胞，在融合后的培 养体系中有 5 种细胞，融合细胞所占比例极小。B 淋巴细胞因不能在体外长期培养，故易于 消除，但骨髓瘤细胞及骨髓瘤与骨髓瘤融合的细胞，其增殖能力较杂交融合细胞强得多，因 此，如何在融合后快速筛选杂交细胞是单克隆抗体技术的关键，筛选方法必须在进行细胞融 合之前确定下来。 HAT 筛选培养液是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。细胞 DNA 生物合成有两条途径，一条是主要途径，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而 合成 DNA。在这条合成途径中叶酸衍生物是必不可少的中间体，它参与嘌呤环和胸腺嘧啶 甲基的生物合成。甲氨喋呤是一种叶酸拮抗剂，可以阻断 DNA 生物合成的主要途径，在 HAT 选择培养基中含有甲氨喋呤，因此在 HAT 培养液中细胞的 DNA 合成主要途径被阻断， 需要利用另一条途径，即补救途径来合成 DNA。利用补救途径合成 DNA 需依赖次黄嘌呤、 胸腺嘧啶脱氧核苷等 DNA 前体的存在，而且细胞内要有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和 胸腺嘧啶核苷激酶（hymidine kinases，TK），若缺乏其中一种酶，该补救途径便不能发挥作 用。 Littlefield 用两种突变细胞株，一种缺失 TK 酶，但保留 HGPRT 酶，另一种则正相反， 缺失 HGPRT 酶，而保留 TK 酶，在通常培养条件下，因为细胞可利用叶酸（folio acid）经 主要合成途径合成 DNA，所以这些酶的缺失对细胞生存并无影响。只有当主要合成途径被 甲氨喋呤封闭时，具有酶缺失的这些细胞便不能存活。若将这两种细胞融合，只有杂交瘤细 胞能在 HAT 培养液中生存。因为一种亲代细胞补充了另一种亲代细胞的酶缺失，因此杂交 瘤细胞能在筛选培养液中存活。没有融合的亲代细胞，或相同亲代细胞融合产生的同核体则 不能存活，因为他们仍然缺失 TK 酶或 HGPRT 酶。 一般而言，使骨髓瘤细胞突变，并筛选出 HGPRT 酶缺失的细胞较 TK 酶缺失的细胞更 容易一些。在正常情况下，每个细胞的 X 染色体只有一个活性拷贝，所以在理论上单个突 变即可产生 HGPRT 酶缺失的突变体。为了获得这种突变体，常用的方法是用浓度为 20μg/ml 的 8-杂氮鸟嘌呤或 6-硫代鸟嘌呤诱导骨髓瘤细胞使其成为 HGPRT 酶缺失的突变体。这是由 于 HGPRT 酶的特异性差，在嘌呤核苷酸的补救途径中也可以将嘌呤类似物 8-杂氮鸟嘌呤或 6-硫代鸟嘌呤掺入到 DNA 中，引起细胞死亡。逐步提高这些药物的浓度可使所有具有 HGPRT 酶的细胞都死亡，只有缺失该酶的突变细胞能存活。缺乏 HGPRT 酶或 TK 酶的细胞 同时失去了 DNA 合成的补救途径，也就获得了对 HAT 的敏感性。 突变株骨髓瘤细胞与脾细胞融合后，脾脏 B 细胞的 HGPRT 酶提供了 DNA 合成的补救 途径，所以杂交产生的异核体可在 HAT 中存活增殖，并产生均一的、具有特异性的抗体