第四章单克隆杭体 即单克降抗体。而未融合的骨随瘤细胞及骨髓瘤细胞的自身融合细胞因HGRT的缺陷，在 HAT培养基中不能生长，B细胞作为终末分化细胞，自身亦不能在体外传代培养。因此， 通过H4T选择培养，最终筛选获得的只能是骨随瘤细胞与B细胞的融合细胞。 细胞融合之后，只有不到50%的孔中有杂交瘤细胞生长，而这其中又只有少数杂交辩 细胞分泌的抗体具有针对免疫原的专一性，必须及时、准确地将这些细胞筛选出来。筛选方 法应快速、可靠，并能同时进行大量的样本箭选。因为每次细胞融合后，往往有上百个培养 孔的上清液需要尽快作出阴性和阳性的判断，这里并不需要精确的定量数据。此外，融合的 杂交南细胞不稳定，容易失去分够抗体的染鱼体，并容易被不产生抗体的细胞生长付成所排 挤，为此及早进行克隆化也要求筛选这一步迅速完成。用相差显微镜观察，当大部分长有杂 交瘤细胞的培养孔达到10%~25%满时，可以开始进行筛选，对小鼠杂交瘤细胞，筛选的 时间大约在融合后的10一14天。理论上讲，任何检测体液抗体的方法都可以用于筛选杂交 瘤细胞，实际工作中可根据抗原的性质、抗体的类型及所需敏感度等具体情况来选择。根据 选择的筛选方法，准备例如ELISA、间接免疫荧光、放射免疫测定等方法所需的材料，具体 步骤如下： 1,用相差显微镜观察杂交瘤细胞，估计生长有杂交瘤细胞的培养孔的数目，以便确定 是筛选所有培养孔的上清还是筛选有细胞生长孔的上清， 2,换液后，细胞在37C、5%C0,培养箱中培养>2天。 注：这期间不能换液以防上清被稀释。 3.从要检测的孔中取1O0如l上清用于检测，如ELISA,间接兔疫荧光等。 注：用微量加样器取上清液时，每孔应换用新吸头。如果检测全部培养孔的上清液，可 以使用多道微量加样器收集上清，同时记录样品在培养板上的位置。 四、杂交瘤细胞的扩增、冻存和克隆化 一旦确认了分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行扩增和冻存，同时进行克隆化，这些 工作不必等到抗体的特性被充分确定就应进行。扩增并冻存杂交瘤细胞，使筛选出的分泌抗 体的杂交瘤有了可靠的来源。早期克隆化的目的是防止非分泌细胞过度生长，但非生产型突 变的可能始终存在，所以有必要进行几次的克隆化。早期克隆阶段中阳性克隆很易丢失，加 入一定的饲养细胞或饲养细胞上清有助于提高克隆效率。克隆化培养的方法，包括有限稀释 法、软琼脂平板法、显微操作法以及FACS分离技术等。其中有限稀释法最常应用，可以直 接检测它的上清液。 (一)饲养细胞上清的准备 最初的杂交瘤细胞在密度低时生长状况不良甚至死亡，许多研究者用饲养细胞提供合适 的环境以促进杂交瘤细胞生长和克隆形成。常用的饲养细胞包括胸腺细胞、脾细胞、腹腔细 胞等。但直接往培养孔中加入新鲜分离的或经射线照射的饲养细胞，有时会引起污染，因而 可以使用不含细胞的、经过滤除菌的饲养细胞上清来提高杂交瘤细胞的克隆效率，注意不要 使用麻醉剂。饲养细胞对杂交细胞没有种属特异性，不必一定是来自相同种属的动物，大 -61 第四章 单克隆抗体 - 61 - 即单克隆抗体。而未融合的骨髓瘤细胞及骨髓瘤细胞的自身融合细胞因 HGPRT 的缺陷，在 HAT 培养基中不能生长，B 细胞作为终末分化细胞，自身亦不能在体外传代培养。因此， 通过 HAT 选择培养，最终筛选获得的只能是骨髓瘤细胞与 B 细胞的融合细胞。 细胞融合之后，只有不到 50％的孔中有杂交瘤细胞生长，而这其中又只有少数杂交瘤 细胞分泌的抗体具有针对免疫原的专一性，必须及时、准确地将这些细胞筛选出来。筛选方 法应快速、可靠，并能同时进行大量的样本筛选。因为每次细胞融合后，往往有上百个培养 孔的上清液需要尽快作出阴性和阳性的判断，这里并不需要精确的定量数据。此外，融合的 杂交瘤细胞不稳定，容易失去分泌抗体的染色体，并容易被不产生抗体的细胞生长过盛所排 挤，为此及早进行克隆化也要求筛选这一步迅速完成。用相差显微镜观察，当大部分长有杂 交瘤细胞的培养孔达到 10％～25％满时，可以开始进行筛选，对小鼠杂交瘤细胞，筛选的 时间大约在融合后的 10～14 天。理论上讲，任何检测体液抗体的方法都可以用于筛选杂交 瘤细胞，实际工作中可根据抗原的性质、抗体的类型及所需敏感度等具体情况来选择。根据 选择的筛选方法，准备例如 ELISA、间接免疫荧光、放射免疫测定等方法所需的材料，具体 步骤如下： 1．用相差显微镜观察杂交瘤细胞，估计生长有杂交瘤细胞的培养孔的数目，以便确定 是筛选所有培养孔的上清还是筛选有细胞生长孔的上清。 2．换液后，细胞在 37℃、5％CO2培养箱中培养≥2 天。 注：这期间不能换液以防上清被稀释。 3．从要检测的孔中取 100μl 上清用于检测，如 ELISA，间接免疫荧光等。 注：用微量加样器取上清液时，每孔应换用新吸头。如果检测全部培养孔的上清液，可 以使用多道微量加样器收集上清，同时记录样品在培养板上的位置。 四、杂交瘤细胞的扩增、冻存和克隆化 一旦确认了分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行扩增和冻存，同时进行克隆化，这些 工作不必等到抗体的特性被充分确定就应进行。扩增并冻存杂交瘤细胞，使筛选出的分泌抗 体的杂交瘤有了可靠的来源。早期克隆化的目的是防止非分泌细胞过度生长，但非生产型突 变的可能始终存在，所以有必要进行几次的克隆化。早期克隆阶段中阳性克隆很易丢失，加 入一定的饲养细胞或饲养细胞上清有助于提高克隆效率。克隆化培养的方法，包括有限稀释 法、软琼脂平板法、显微操作法以及 FACS 分离技术等。其中有限稀释法最常应用，可以直 接检测它的上清液。 (一)饲养细胞上清的准备 最初的杂交瘤细胞在密度低时生长状况不良甚至死亡，许多研究者用饲养细胞提供合适 的环境以促进杂交瘤细胞生长和克隆形成。常用的饲养细胞包括胸腺细胞、脾细胞、腹腔细 胞等。但直接往培养孔中加入新鲜分离的或经射线照射的饲养细胞，有时会引起污染，因而 可以使用不含细胞的、经过滤除菌的饲养细胞上清来提高杂交瘤细胞的克隆效率，注意不要 使用麻醉剂。饲养细胞对杂交瘤细胞没有种属特异性，不必一定是来自相同种属的动物，大