第四章单克隆杭保 鼠来源的饲养细胞也可用于小鼠小鼠杂交瘤细胞。下面介绍胸腺细胞上清的制备。 1。无菌取出胸腺，放入盛有完全培养基的平皿中，小心剥除外面的结缔组织.将胸脑 置于不锈钢网上，用小剪刀剪碎，注射器针芯挤压，制成胸腺细胞悬液。 2.细胞悬液移入50ml离心管，用培养基离心洗涤(500×g、室温离心5min)。 3.弃去上清，按每只胸腺20ml加入完全培养基重悬细胞，细胞悬液移入培养瓶，37℃ 5%C02培养箱中培养4~5天。 4.细胞悬液移入50ml离心管，1000×g室温离心5min,收集上清。 5.上清过滤除菌，分装10m/瓶，-20℃冻存备用。使用前溶化，按终浓度10%~20% 加入培养基。 (仁)骨罐瘤细胞的扩增和冻存 1.96孔板中的细胞长到25%~50%满时，将筛选出来的阳性孔用吸管将细胞悬起，细 胞悬液移入24孔板。注意：96孔板中应留下足够的细胞继续培养。移入24孔板的细胞数 过少时，细胞可能生长不良。但如果原96孔板中有成纤维细胞生长，则应尽早转移细胞以 防成纤维细胞过度生长（如果必要可以转入另一96孔板）。 2.96孔板的原孔中加入三滴完全培养基，24孔板中加入1~一1.5ml含饲养细胞上清的 培养基，放入培养箱培养。 注：24孔板和96孔板的两个培养孔应作为独立单位操作，应使用不同的滴管和不同瓶 的培养基，以防两孔同时污染。 3.约2~3天后，24孔板中的细胞长满25%~50%孔底，可以收集细胞按后述方法克 隆化。 4。取出足铭讲行克降化的细胞后，将部分剩余细移入5m离心，管。4板加入新群 培养基继续培养。 5.离心管中的细胞计数后室温离心500×g、5分钟。上清可以用于进一步检测，细胞则 准备液氮冻存。 注：杂交瘤细胞系只有在得到了稳定的克隆并成功地冻存和复苏之后才算建立。如果经 有限稀释法克隆后没有得到分泌特异抗体的细胞系，这里冻存的细胞复苏后种入24孔板， 扩增后再次进行有限稀释克隆化，同时液氨冻存 6.细胞用含有50%FCS的HT培养基按6×10ml重悬，细胞悬液中加入等体积含30% DMSO的DMEM培养基（不含血清），充分混合 注：因为在液态时DMSO对细胞有毒性，所以DMSO加入后，冻存的步骤应尽快完成。 7.混合后的细胞悬液按每管2ml加入冻存管，密封，贴上标签。 8.冻存管放入液氮罐顶部的液氮蒸汽中，使管中的悬液以每分钟1℃的速度逐渐冷却， 弘后可将冻存管送入液氮保存 9.复苏时，冻存管从液氮取出，立即投入37C℃水浴，震摇，使之在1~2mi内迅速融 化，然后用50ml培养液稀释，离心收集细胞，50ml培养液再次洗涤一次后，用完全 DMEM/HEPES培养液重悬，进行培养。 (巨)有限稀释法克隆化 -62第四章 单克隆抗体 - 62 - 鼠来源的饲养细胞也可用于小鼠-小鼠杂交瘤细胞。下面介绍胸腺细胞上清的制备。 1．无菌取出胸腺，放入盛有完全培养基的平皿中，小心剥除外面的结缔组织，将胸腺 置于不锈钢网上，用小剪刀剪碎，注射器针芯挤压，制成胸腺细胞悬液。 2．细胞悬液移入 50ml 离心管，用培养基离心洗涤（500×g、室温离心 5min）。 3．弃去上清，按每只胸腺 20ml 加入完全培养基重悬细胞，细胞悬液移入培养瓶，37℃、 5％CO2培养箱中培养 4～5 天。 4．细胞悬液移入 50ml 离心管，1000×g 室温离心 5min，收集上清。 5．上清过滤除菌，分装 10ml/瓶，-20℃冻存备用。使用前溶化，按终浓度 10％～20％ 加入培养基。 (二) 骨髓瘤细胞的扩增和冻存 1．96 孔板中的细胞长到 25％～50％满时，将筛选出来的阳性孔用吸管将细胞悬起，细 胞悬液移入 24 孔板。注意：96 孔板中应留下足够的细胞继续培养。移入 24 孔板的细胞数 过少时，细胞可能生长不良。但如果原 96 孔板中有成纤维细胞生长，则应尽早转移细胞以 防成纤维细胞过度生长（如果必要可以转入另一 96 孔板）。 2．96 孔板的原孔中加入三滴完全培养基，24 孔板中加入 1～1.5ml 含饲养细胞上清的 培养基，放入培养箱培养。 注：24 孔板和 96 孔板的两个培养孔应作为独立单位操作，应使用不同的滴管和不同瓶 的培养基，以防两孔同时污染。 3．约 2～3 天后，24 孔板中的细胞长满 25％～50％孔底，可以收集细胞按后述方法克 隆化。 4．取出足够进行克隆化的细胞后，将部分剩余细胞移入 5ml 离心管。24 孔板加入新鲜 培养基继续培养。 5．离心管中的细胞计数后室温离心 500×g、5 分钟。上清可以用于进一步检测，细胞则 准备液氮冻存。 注：杂交瘤细胞系只有在得到了稳定的克隆并成功地冻存和复苏之后才算建立。如果经 有限稀释法克隆后没有得到分泌特异抗体的细胞系，这里冻存的细胞复苏后种入 24 孔板， 扩增后再次进行有限稀释克隆化，同时液氮冻存。 6．细胞用含有 50％FCS 的 HT 培养基按 6×10 6 /ml 重悬，细胞悬液中加入等体积含 30％ DMSO 的 DMEM 培养基（不含血清），充分混合。 注：因为在液态时 DMSO 对细胞有毒性，所以 DMSO 加入后，冻存的步骤应尽快完成。 7．混合后的细胞悬液按每管 2ml 加入冻存管，密封，贴上标签。 8．冻存管放入液氮罐顶部的液氮蒸汽中，使管中的悬液以每分钟 1℃的速度逐渐冷却， 3h 后可将冻存管送入液氮保存。 9．复苏时，冻存管从液氮取出，立即投入 37℃水浴，震摇，使之在 1～2min 内迅速融 化，然后用 50ml 培养液稀释，离心收集细胞，50ml 培养液再次洗涤一次后，用完全 DMEM/HEPES 培养液重悬，进行培养。 (三) 有限稀释法克隆化