第四章单克隆杭体 Poisson统计分析，如果理论上按每孔0.3个细胞接种96孔板，只有<22%的孔有细胞 生长，这其中88%的孔是单克隆孔。但新融合细胞的克隆效率低，为得到一定数量有细胞 生长的孔，就要增加每孔接种的细胞数。在未知刚分离的杂交瘤细胞的克隆效率的大致范围 时，可选用几种不同的浓度进行接种，以提高获得单细胞克隆的可能性 1,从上述24孔板中取出杂交痴细胞，计数并用台盼蓝或伊红计算活细胞比例。 2.根据细胞数目，用含饲养细胞上清的培养基配制50个细胞/ml,15个细胞ml和5 个细胞/ml三种浓度的细胞悬液各20ml。 注：最好用系列稀释来得到所需细胞浓度，而不要把小体积高浓度的细胞直接稀释成大 体积。 3.96孔板中每孔加入200如细胞悬液，每个浓度各加满一板，理论上每孔分别是10 个细胞、3个细胞和1个细胞。37℃、5%C02培养箱中培养7一10天。 4.用相差显微镜观察细胞，查看板底有无一簇紧密生长的细胞，可认为是单一克隆 如果板底有几簇细胞生长，可认为是多克隆来源的，最好不用。 5.在克隆的第7~14天，用筛选杂交瘤细胞的方法检测单克隆孔的抗体活性。用已知 阳性的杂交瘤上清作为阳性对照。 注：小鼠一小鼠杂交瘤细胞可以在第7天就检测抗体活性，而仓鼠一小鼠杂交则需生 长到第14天。培养孔中上清变黄就可以检测这一孔。如果中间换液，要在2天后取上清进 行检测。 6.当确定阳性克隆后，将这一孔的细胞扩增并冻存。 7.将上述阳性克隆按0.3细胞/吼(60个细胞/40ml培养基)接种96孔板，再次克降 化，重复第(4)一(6)步。 8.用完全培养基每天按1：2将重新克隆的细胞传代。如果细胞能稳定生长，可以认为 已经建成了杂交瘤细胞系。 注：在不同时间用不同瓶的冻存液冻存多支细胞，复苏一些细胞，检查细胞的生长状况 和上清中抗体的活性，合格后，杂交瘤细胞就可以用于制备腹水或大量培养制备上清。这时 可以测定单克隆抗体的类型。 即使再次克隆的杂交瘤细胞也有不稳定的表型，尤其是仓鼠小鼠杂交瘤细胞，需要定 期进行再克隆。体外长期培养可能导致丢失产生单抗的能力，解决的办法是将确定分泌抗体 的细胞进行较大量的冻存，以此作为细胞的来源。 五、单克隆抗体的大量制备 单卓降抗体相对于多京降抗血洁的一个主要代占就是单抗能够大量生产，一般单抗产品 包括杂交瘤细胞培养上清和纯化的单克隆抗体。制备杂交瘤细胞培养上清操作简单，尤其要 同时制备多种不同种类单抗时适用，但杂交瘤细胞培养上清中抗体浓度较低。腹水中含有高 浓度的单克隆抗体，但也含有一些非单抗成分。纯化单抗可采用亲和层析等方法。这里介绍 ·般制备杂交瘤细胞培养上清的方法、大规模制备上清的方法和制备腹水的方法。 （一）制备杂交瘤培养上清 -63 第四章 单克隆抗体 - 63 - Poisson 统计分析，如果理论上按每孔 0.3 个细胞接种 96 孔板，只有<22％的孔有细胞 生长，这其中 88％的孔是单克隆孔。但新融合细胞的克隆效率低，为得到一定数量有细胞 生长的孔，就要增加每孔接种的细胞数。在未知刚分离的杂交瘤细胞的克隆效率的大致范围 时，可选用几种不同的浓度进行接种，以提高获得单细胞克隆的可能性。 1．从上述 24 孔板中取出杂交瘤细胞，计数并用台盼蓝或伊红计算活细胞比例。 2．根据细胞数目，用含饲养细胞上清的培养基配制 50 个细胞/ml，15 个细胞/ml 和 5 个细胞/ml 三种浓度的细胞悬液各 20ml。 注：最好用系列稀释来得到所需细胞浓度，而不要把小体积高浓度的细胞直接稀释成大 体积。 3．96 孔板中每孔加入 200μl 细胞悬液，每个浓度各加满一板，理论上每孔分别是 10 个细胞、3 个细胞和 1 个细胞。37℃、5％CO2培养箱中培养 7～10 天。 4．用相差显微镜观察细胞，查看板底有无一簇紧密生长的细胞，可认为是单一克隆。 如果板底有几簇细胞生长，可认为是多克隆来源的，最好不用。 5．在克隆的第 7～14 天，用筛选杂交瘤细胞的方法检测单克隆孔的抗体活性。用已知 阳性的杂交瘤上清作为阳性对照。 注：小鼠一小鼠杂交瘤细胞可以在第 7 天就检测抗体活性，而仓鼠一小鼠杂交瘤则需生 长到第 14 天。培养孔中上清变黄就可以检测这一孔。如果中间换液，要在 2 天后取上清进 行检测。 6．当确定阳性克隆后，将这一孔的细胞扩增并冻存。 7．将上述阳性克隆按 0.3 细胞/孔（60 个细胞/40ml 培养基）接种 96 孔板，再次克隆 化，重复第（4）～（6）步。 8．用完全培养基每天按 1：2 将重新克隆的细胞传代。如果细胞能稳定生长，可以认为 已经建成了杂交瘤细胞系。 注：在不同时间用不同瓶的冻存液冻存多支细胞，复苏一些细胞，检查细胞的生长状况 和上清中抗体的活性，合格后，杂交瘤细胞就可以用于制备腹水或大量培养制备上清。这时 可以测定单克隆抗体的类型。 即使再次克隆的杂交瘤细胞也有不稳定的表型，尤其是仓鼠-小鼠杂交瘤细胞，需要定 期进行再克隆。体外长期培养可能导致丢失产生单抗的能力，解决的办法是将确定分泌抗体 的细胞进行较大量的冻存，以此作为细胞的来源。 五、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体相对于多克隆抗血清的一个主要优点就是单抗能够大量生产，一般单抗产品 包括杂交瘤细胞培养上清和纯化的单克隆抗体。制备杂交瘤细胞培养上清操作简单，尤其要 同时制备多种不同种类单抗时适用，但杂交瘤细胞培养上清中抗体浓度较低。腹水中含有高 浓度的单克隆抗体，但也含有一些非单抗成分。纯化单抗可采用亲和层析等方法。这里介绍 一般制备杂交瘤细胞培养上清的方法、大规模制备上清的方法和制备腹水的方法。 (一) 制备杂交瘤培养上清