第四章单克隆杭保 可以采用不同方式扩增杂交瘤细胞，收获上清后测定抗体滴度。如果抗体滴度高，杂交 应细胞可以用于大规模培养或用于制各腹水。所需材料有杂交脑细胞、完全D八MEM培养基、 175cm2培养瓶、50ml离心管等。 1.杂交瘤细胞扩增入175cm2培养瓶，放入37C、5%CO,培养箱培养 注：大多数细胞系在细胞密度达1~2x10的ml时进行转代，可以在相差显微镜下观察细 胞状态和密度。除非准备收获上清，细胞绝不能过度生长出现死亡，应一直保持在对数生长 状态，以减少不利环境对它的逆向选择，控制非生产型变种的生长。 2.按1：10将细胞传入新的培养瓶，加入新鲜的培养基培养，直到细胞过度生长，培养 基变黄，细胞出现死亡（约5天后）。 注：也可以采用其它方式，在新鲜培养基中加入高密度细胞(1~2×10细胞/ml)移入 培养瓶培养，2一3天后细胞出现死亡，收集上清。 3.将培养物移入50ml离心管，1500×g室温离心10mim,收集上清液。 4.用适当的方法检测抗体滴度。 5.分装上清无菌保存。一般4℃可以保存几个星期到几个月，20°C或70℃可以保存数 月到数年。应尽量减少冻融次数。 (仁)大规模制备杂交瘤细胞培养上清 亲和层析纯化单克隆抗体的第一步就是要制备大量的培养上清，下面介绍用滚动式培养 瓶大规模制备单克隆抗体上清的方法。细胞先在小培养瓶中培养，逐渐传入大体积的滚动式 培养瓶，然后收集上清冻存备用。所需材料有完全培养基、70%乙醇、175cm2培养瓶、850cm2 滚动式培养瓶及相应设备、250ml离心管。 1.按前面介绍的方法用175cm2培养瓶将杂交瘤细胞1：10传代，总体积达到100ml。 注：应根据最终需要单克隆抗体的量决定培养规模。如果用亲和层析纯化上清，一般每 升上清可得到1一10mg纯化产品。一般不用无血清培养基培养细胞，它会降低单抗产率。如 果准备用蛋白A亲和层析纯化上清中的单抗，应事先检测含FCS的培养基中是否含有能与 单抗一起被纯化的蛋白成分。新生牛血清常含有较多的免疫球蛋白能结合蛋白A,此种情况 下一般不使用于杂交瘤细胞的培养。 2.当细胞长到适当密度，将培养物从175cm2培养瓶(100ml)转入850cm2滚动式培养 瓶，再加入150ml新鲜培养基，培养1~2天。 3.用70%酒精浸泡的棉球消毒瓶口，打开瓶盖，培养物中再加入250ml新鲜培养基（总 体积500ml),盖紧瓶盖，维续培养1-2天。 4.消毒瓶口后打开瓶盖，加入约2L新鲜的完全DMEM培养液（总体积约2.5L),继 续培养至培养液颜色变黄（约5天）。 注：滚动时间不能过长，否则出现的细胞碎片残渣在离心时很难去除。 5.将培养物转入250ml离心管，250g离心20min。收集上清，分装保存。 注：如果上清不用于生物活性试验，加入10%的叠氨钠至终浓度0.02%。如果上清用 于亲和层析纯化或盐析纯化，最好用0.45m的滤膜过滤去除残渣。 (巨)制备单克隆抗体腹水 -64第四章 单克隆抗体 - 64 - 可以采用不同方式扩增杂交瘤细胞，收获上清后测定抗体滴度。如果抗体滴度高，杂交 瘤细胞可以用于大规模培养或用于制备腹水。所需材料有杂交瘤细胞、完全 DMEM 培养基、 175cm2培养瓶、50ml 离心管等。 1．杂交瘤细胞扩增入 175cm2培养瓶，放入 37℃、5％CO2培养箱培养。 注：大多数细胞系在细胞密度达 l～2×10 6 /ml 时进行转代，可以在相差显微镜下观察细 胞状态和密度。除非准备收获上清，细胞绝不能过度生长出现死亡，应一直保持在对数生长 状态，以减少不利环境对它的逆向选择，控制非生产型变种的生长。 2．按 1:10 将细胞传入新的培养瓶，加入新鲜的培养基培养，直到细胞过度生长，培养 基变黄，细胞出现死亡（约 5 天后）。 注：也可以采用其它方式，在新鲜培养基中加入高密度细胞（1～2×10 6细胞/ml）移入 培养瓶培养，2～3 天后细胞出现死亡，收集上清。 3．将培养物移入 50ml 离心管，1500×g 室温离心 10min，收集上清液。 4．用适当的方法检测抗体滴度。 5．分装上清无菌保存。一般 4℃可以保存几个星期到几个月，-20℃或-70℃可以保存数 月到数年。应尽量减少冻融次数。 (二) 大规模制备杂交瘤细胞培养上清 亲和层析纯化单克隆抗体的第一步就是要制备大量的培养上清，下面介绍用滚动式培养 瓶大规模制备单克隆抗体上清的方法。细胞先在小培养瓶中培养，逐渐传入大体积的滚动式 培养瓶，然后收集上清冻存备用。所需材料有完全培养基、70％乙醇、175cm2培养瓶、850cm2 滚动式培养瓶及相应设备、250ml 离心管。 1．按前面介绍的方法用 175cm2培养瓶将杂交瘤细胞 1:10 传代，总体积达到 100ml。 注：应根据最终需要单克隆抗体的量决定培养规模。如果用亲和层析纯化上清，一般每 升上清可得到 l～10mg 纯化产品。一般不用无血清培养基培养细胞，它会降低单抗产率。如 果准备用蛋白 A 亲和层析纯化上清中的单抗，应事先检测含 FCS 的培养基中是否含有能与 单抗一起被纯化的蛋白成分。新生牛血清常含有较多的免疫球蛋白能结合蛋白 A，此种情况 下一般不使用于杂交瘤细胞的培养。 2．当细胞长到适当密度，将培养物从 175cm2培养瓶（100ml）转入 850cm2滚动式培养 瓶，再加入 150ml 新鲜培养基，培养 1～2 天。 3．用 70％酒精浸泡的棉球消毒瓶口，打开瓶盖，培养物中再加入 250ml 新鲜培养基（总 体积 500ml），盖紧瓶盖，继续培养 1～2 天。 4．消毒瓶口后打开瓶盖，加入约 2L 新鲜的完全 DMEM 培养液（总体积约 2.5L），继 续培养至培养液颜色变黄（约 5 天）。 注：滚动时间不能过长，否则出现的细胞碎片残渣在离心时很难去除。 5．将培养物转入 250ml 离心管，250g 离心 20min。收集上清，分装保存。 注：如果上清不用于生物活性试验，加入 10％的叠氮钠至终浓度 0.02％。如果上清用 于亲和层析纯化或盐析纯化，最好用 0.45μm 的滤膜过滤去除残渣。 (三) 制备单克隆抗体腹水