第四章单克隆杭体 接种到适当的动物体内，杂交瘤细胞能在动物体内生长并产生大量免疫球蛋白。从皮下 接种杂交瘤，可以从血清中收获抗体，从腹腔中接种杂交瘤，它可以在腹腔中产生类似血清 的液体一腹水。腹腔接种后在腹水和血清中都可收获抗体。这些抗体大部分是由杂交瘤细胞 产生的单克隆抗体，但也含有宿主产生的免疫球蛋白。考虑到抗体产量，动物接种最常采用 腹腔注射，从小鼠很容易得到5~15ml腹水。接种的动物一般应选择与杂交瘤细胞同系的动 物，因为骨髓瘤细胞和脾细胞最多来源于BALB/小鼠，所以制备腹水也最多用这一品系的 小鼠。如果骨随瘤细胞是其它种属米源的，可以在无胸腺的裸鼠或射线照射的小鼠体内接种。 注射细胞前一般先用隆描烷处理腹腔，以便产生大量腹水。所需材料有6一8围的BALB 小鼠（或裸鼠），降植烷(Pristane)、杂交瘤细胞、无茵PBS或HBSS、56℃水浴、注射器、 离心管、培养瓶等。 1.注射细胞的前一周，小鼠腹腔内注射0.5-1l降植烷。 2.培养细胞，使细胞处于对数生长期。 3.细胞培养物移入50ml离心管，500g离心5min,弃上清，细胞重悬于50ml不含FCS 的PBS或HBSS中，离心洗涤，弃去上清，再清洗两次，弃上清后用5 ml PBS或HBSS将 细胞重悬。 注：动物会对培养基中含有的血清产生抗体，所以要用无血清的缓冲液清洗细胞 4.计数细胞，活细胞应接近100%。 5.用PBS或HBSS将细胞配成2.5x10ml 6.每只小鼠腹腔内注入上述细胞悬液2ml,约1~2周后形成腹水。 7.采集腹水时一只手从背部抓牢小鼠，使小鼠腹部皮肤紧张，另一只手把1个18G的 针头插入腹腔内1~2cm,注意针头应插入腹腔的左侧或右侧下方，以避开腹腔上部的重要 器官及腹中部的大血管，用15ml的离心管收集腹水。 注：如果腹水中间停止流出，可将针头退出一部分换方向再重新插入。 8.将腹水1500g离心5mim,收集上清，先放于4℃保存 9.约2一3天后，小鼠又重新出现腹水，按上述方法再次收集腹水。腹水可以收集若干 次，一直到动物不再长出腹水（一般不超过一周）。 10.将前面几次收集的腹水混和，56℃水浴灭活45min。如果出现了结块，可以离心去 除。 注：灭活可以去除补体成分和一些蛋白酶的影响。应在玻璃容器中进行，以防塑料制品 化学成分可能的影响。 11,用活当的方法测定腹水中单克隆抗体的滴度」 注：一般腹水中单抗的活性最高在0.5%或更高的稀释度。抗体滴度偏低可能由于杂交 瘤细胞不稳定发生了非生产型突变或由于体外连续传代太多。 12.将腹水稀释(>1：10)，用0.4um的滤膜过滤除菌。分装后保存于-70℃，避免反复 冻融。可保存数年之久。 (四)单克隆抗体的鉴定 对制备的Mb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定： -65 第四章 单克隆抗体 - 65 - 接种到适当的动物体内，杂交瘤细胞能在动物体内生长并产生大量免疫球蛋白。从皮下 接种杂交瘤，可以从血清中收获抗体，从腹腔中接种杂交瘤，它可以在腹腔中产生类似血清 的液体—腹水。腹腔接种后在腹水和血清中都可收获抗体。这些抗体大部分是由杂交瘤细胞 产生的单克隆抗体，但也含有宿主产生的免疫球蛋白。考虑到抗体产量，动物接种最常采用 腹腔注射，从小鼠很容易得到 5～15ml 腹水。接种的动物一般应选择与杂交瘤细胞同系的动 物，因为骨髓瘤细胞和脾细胞最多来源于 BALB/c 小鼠，所以制备腹水也最多用这一品系的 小鼠。如果骨髓瘤细胞是其它种属来源的，可以在无胸腺的裸鼠或射线照射的小鼠体内接种。 注射细胞前一般先用降植烷处理腹腔，以便产生大量腹水。所需材料有 6～8 周的 BALB/c 小鼠（或裸鼠），降植烷（Pristane）、杂交瘤细胞、无菌 PBS 或 HBSS、56℃水浴、注射器、 离心管、培养瓶等。 1．注射细胞的前一周，小鼠腹腔内注射 0.5～l ml 降植烷。 2．培养细胞，使细胞处于对数生长期。 3．细胞培养物移入 50ml 离心管，500g 离心 5min，弃上清，细胞重悬于 50ml 不含 FCS 的 PBS 或 HBSS 中，离心洗涤，弃去上清，再清洗两次，弃上清后用 5ml PBS 或 HBSS 将 细胞重悬。 注：动物会对培养基中含有的血清产生抗体，所以要用无血清的缓冲液清洗细胞。 4．计数细胞，活细胞应接近 100％。 5．用 PBS 或 HBSS 将细胞配成 2.5×10 6 /ml。 6．每只小鼠腹腔内注入上述细胞悬液 2ml，约 1～2 周后形成腹水。 7．采集腹水时一只手从背部抓牢小鼠，使小鼠腹部皮肤紧张，另一只手把 1 个 18G 的 针头插入腹腔内 1～2cm，注意针头应插入腹腔的左侧或右侧下方，以避开腹腔上部的重要 器官及腹中部的大血管，用 15ml 的离心管收集腹水。 注：如果腹水中间停止流出，可将针头退出一部分换方向再重新插入。 8．将腹水 1500g 离心 5min，收集上清，先放于 4℃保存。 9．约 2～3 天后，小鼠又重新出现腹水，按上述方法再次收集腹水。腹水可以收集若干 次，一直到动物不再长出腹水（一般不超过一周）。 10．将前面几次收集的腹水混和，56℃水浴灭活 45min。如果出现了结块，可以离心去 除。 注：灭活可以去除补体成分和一些蛋白酶的影响。应在玻璃容器中进行，以防塑料制品 化学成分可能的影响。 11．用适当的方法测定腹水中单克隆抗体的滴度。 注：一般腹水中单抗的活性最高在 0.5％或更高的稀释度。抗体滴度偏低可能由于杂交 瘤细胞不稳定发生了非生产型突变或由于体外连续传代太多。 12．将腹水稀释（>1:10），用 0.4μm 的滤膜过滤除菌。分装后保存于－70℃，避免反复 冻融。可保存数年之久。 (四) 单克隆抗体的鉴定 对制备的 McAb 进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：