SDS溶液50μl、O.05mol/ L EDTA溶液(pH8.O)10u1,56℃培养1小时,用等体积的 酚 三氯甲烷(1:1)混合液抽提后,再用等体积的三氯甲烷抽提,加2倍体积的乙醇, 20℃放置16小时,以每分钟10000转离心15分钟,沉淀用75%乙醇溶液洗涤干燥 加无DNA酶和RNA酶的水10μ1,使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同 时处理 引物 VPl上游引物:22205※ ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240 VPl下游引物:23195※ GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297 T抗原C末端上游引物:30705※- GAC CTG TGG CTG AGT TIG CTCA-3”3049 T抗原c末端下游引物:26195’ GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2 检查法(1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12mol,DNA模板加量为1ul, 体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟:94℃变性20秒、50℃C退火20秒、72℃ 延 伸40秒共进行40个循环;72℃延伸3分钟。 (2)扩增产物电泳检査:2%琼脂糖凝胶(每lm含1μg溴化乙锭,缓冲液为1×TAE, 在100ⅴ条件下电泳40分钟,检査扩增片段。VPl扩增片段为100bp,大T抗原C末端 片段为45bp 3)以同样模板重复扩增ⅤP片段,排除污染因素导致的非特异扩增;或将扩增 产物及对照从胶上移至 Hybond N尼龙膜上,与ⅤP探针进行免疫印迹试验以证明 所扩增片段确为VPI片段。 (4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C末端扩增产物进行序列测 结果判定阳性对照应得到特异产物,阴性对照应无相应片段,则试验成立 若未能扩出VPl片段,则结果判定为未检出SV40核酸序列。 若扩增出VP片段,可重复试验1次,仍未扩增出ⅤP片段者,判定为未检出 SV40核酸序列。 若重试仍能扩增出ⅤP片段,则应扩增大T抗原C-末端片段,如扩增出大T抗原 C-末端片段,则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较,核酸序列 致判定为检出S40核酸序列:如未扩增出大T抗原C-末端片段,则可按上述步骤 (1)~(3)重复试验1次,如仍未扩增出大T抗原C末端片段,则可判定为未检出 SV40核酸序列。 页码数:2005版药典附录第24页 附录Ⅴ 除另有规定外,水溶液的pH值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为 参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定,并符合国家有关规 定。测定前,应采用下列标准缓冲液校正仪器,也可用国家标准物质管理部门 发放的标示pH值准确至0.0lp单位的各种标准缓冲液校正仪器 1.仪器校正用的标准缓冲液SDS 溶液 50μl、O．05mol／L EDTA 溶液(pH8．O)10μ1，56℃培养 1 小时，用等体积的 酚 -三氯甲烷(1：1)混合液抽提后，再用等体积的三氯甲烷抽提，加 2 倍体积的乙醇， -20℃放置 16 小时，以每分钟 10000 转离心 15 分钟，沉淀用 75％乙醇溶液洗涤干燥， 加无 DNA 酶和 RNA 酶的水 10μl，使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同 时处理。 引物 VPl 上游引物：2220 5※_ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240 VPl 下游引物：2319 5※_GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297 T 抗原 C_末端上游引物：3070 5※-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3’3049 T 抗原 c_末端下游引物：2619 5’一 GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2641 检查法 (1)每个待扩增的供试品引物加量为 30×10-12 mol，DNA 模板加量为 1μl， 总 体积 50μl。在 PCR 仪上以 94℃先变性 3 分钟；94℃变性 20 秒、50℃C 退火 20 秒、72℃ 延 伸 40 秒共进行 40 个循环；72℃延伸 3 分钟。 (2)扩增产物电泳检查：2％琼脂糖凝胶(每 lml 含 1μg 溴化乙锭)，缓冲液为 1×TAE， 在 100V 条件下电泳 40 分钟，检查扩增片段。VPl 扩增片段为 100bp，大 T 抗原 C_末端 片段为 451bp。 (3)以同样模板重复扩增 VPl 片段，排除污染因素导致的非特异扩增；或将扩增 产物及对照从胶上移至 Hybond N 尼龙膜上，与 VPl 探针进行免疫印迹试验以证明 所扩增片段确为 VPl 片段。 (4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大 T 抗原 C_末端扩增产物进行序列测 定。 结果判定 阳性对照应得到特异产物，阴性对照应无相应片段，则试验成立。 若未能扩出 VPl 片段，则结果判定为未检出 SV40 核酸序列。 若扩增出 VPl 片段，可重复试验 1 次，仍未扩增出 VPl 片段者，判定为未检出 SV40 核酸序列。 若重试仍能扩增出 VPl 片段，则应扩增大 T 抗原 C-末端片段，如扩增出大 T 抗原 C-末端片段，则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较，核酸序列一 致判定为检出 SV40 核酸序列；如未扩增出大 T 抗原 C-末端片段，则可按上述步骤 (1)～(3)重复试验 1 次，如仍未扩增出大 T 抗原 C_末端片段，则可判定为未检出 SV40 核酸序列。 页码数： 2005 版药典附录第 24 页 附录 V 除另有规定外，水溶液的 pH 值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为 参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规 定。测定前，应采用下列标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质管理部门 发放的标示 pH 值准确至 0．01pH 单位的各种标准缓冲液校正仪器。 1．仪器校正用的标准缓冲液