三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 (一)凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理加“分离纯化方法”中所述。一定型号的凝脑 颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进 入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱 来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后 被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围 内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标 准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗 脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分 ,根据其所用的洗脱体积。 脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来（图2-29）。 分子量对数 图229蛋白质的分子量与洗脱体积之间的关系 0一外水体积 收一洗散体积 (二)SD$-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、所带电荷的量 以及分子形状。而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了 十二烷基疏酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质 变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS(一般加入量为01%)后，SDS与蛋白质 分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷 这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带 的电荷量， 因而掩 不同蛋白质之间的电荷差异。所有结 SDS 的蛋白 -SDS复合物 的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成正比 这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白质分子量 的大小。 61 61 三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 （一）凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理如“分离纯化方法”中所述。一定型号的凝胶 颗粒上具有一定大小的孔隙，只允许较小的分子进入胶粒，而大于孔隙的分子则不能进 入胶粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下 来，随后能够进入颗粒的蛋白质也按分子量大小而先后被洗脱下来，分子量越小的越后 被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围 内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标 准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗 脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗 脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来（图 2-29）。 图 2-29 蛋白质的分子量与洗脱体积之间的关系 Vo－外水体积 Ve－洗脱体积 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、所带电荷的量 以及分子形状。而 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）。SDS 是一种阴离子去污剂，可使蛋白质 变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入 SDS（一般加入量为 0.1％）后，SDS 与蛋白质 分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带 的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合 SDS 的蛋白质-SDS 复合物 的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成正比。 这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白质分子量 的大小