光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式 (一)荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸( fluorescein-5- isothiocyanate,FTC)、四 乙基罗丹明( tetraethylrod amine B200,RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明 ( tetramethylrhodamine isothiocyanate)、藻红蛋白( phycoerythrin,PE)等,它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光 1.异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 (1)所需试剂及设备 )试剂:被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH9~9.5的碳酸 盐缓冲液(NaCO34.3g、NaCO386g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中)、PBS 缓冲液(pH72)、DMSO 2)材料与设备:透析袋、紫外分光光度计、 Sephadex g25柱等。 (2)操作步骤 1)将纯化过的抗体放入透析袋中,在加有pH9~9.5的碳酸盐缓冲液容器 中4℃透析过夜,透析后抗体被转移到一小烧杯中备用 2)配制FITC-DMSO溶液:称取适量FITC,加入DMSO溶解,使FITC终 浓度保持在1mgm左右。 3)按照适当比例将 FITC-DMSO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。(通 常,当IgG的浓度为lmgm时,FITC的加入量为5μg/ml;当IgG的浓度为 5~10mgm时FIC的加入量则降为25ug/ml)。 4)将上述标记物用PBS稀释至2.5ml,室温下避光搅拌2h 5)用 Sephadex G25柱除去游离荧光素分子,收集第一个PBS洗脱峰(荧 光素蛋白结合峰),按照下式计算F/P值 F/P=287×A495A280-0.35×A495,其中A495、A280分表代表495nm、280nm 下的光吸收值,适当的F/P值应在2~4之间。 6)分装,4℃避光保存备用。 2.四乙基罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:四乙基罗丹明(RB200)、无水丙醇、生理盐水、pH 9~9.5的碳酸盐缓冲液(同上)、透析袋和 Sephadex G50柱等光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。 （一）荧光抗体的制备 常用的荧光素分子主要有异硫氰酸（fluorescein-5-isothiocyanate，FITC）、四 乙基罗丹 明（tetraethylrodamine B200 ，RB200）、四 甲基异 硫氰酸 罗丹明 （tetramethylrhodamine isothiocyanate）、藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等，它们 在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。 1．异硫氰酸荧光素标记抗体的制备 （1）所需试剂及设备 1）试剂：被纯化过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9～9.5 的碳酸 盐缓冲液（Na2CO3 4.3g、NaHCO3 8.6g 溶入到终体积为 500ml 的蒸馏水中）、PBS 缓冲液（pH7.2）、DMSO； 2）材料与设备：透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25 柱等。 （2）操作步骤 1）将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有 pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液容器 中 4℃透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。 2）配制 FITC-DMSO 溶液：称取适量 FITC，加入 DMSO 溶解，使 FITC 终 浓度保持在 1mg/ml 左右。 3）按照适当比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。（通 常，当 IgG 的浓度为 1mg/ml 时，FITC 的加入量为 50µg／ml；当 IgG 的浓度为 5～10mg/ml 时,FITC 的加入量则降为 25µg／ml）。 4）将上述标记物用 PBS 稀释至 2.5ml，室温下避光搅拌 2h。 5）用 Sephadex G25 柱除去游离荧光素分子，收集第一个 PBS 洗脱峰（荧 光素蛋白结合峰），按照下式计算 F/P 值。 F/P＝2.87×A495/A280-0.35×A495，其中 A495、A280 分表代表 495nm、280nm 下的光吸收值, 适当的 F/P 值应在 2～4 之间。 6）分装，4℃避光保存备用。 2．四乙基罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：四乙基罗丹明（RB200）、无水丙醇、生理盐水、pH 9～9.5 的碳酸盐缓冲液（同上）、透析袋和 Sephadex G50 柱等