(2)操作步骤 1)称取lgRB200和2gPCl(五氯化磷)于研钵中仔细研磨5min后加入 loml无水乙醇不断搅拌5min,再用滤纸过滤上述溶液,所得滤液将被用于抗体 标记。(注:RB200可在PCls的作用下转变成磺酰氯SO2Cl,后者在碱性条件下 可与蛋白质的E氨基结合从而实现对抗体的标记。) 2)取抗体(浓度一般在20mg/ml左右)适量,按照每ml抗体各加入1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释,然后逐滴加入O. ImI rB200溶液,边加边 搅拌。 3)0~4℃结合12~18h,再用生理盐水透析5~7h 4)经 Sephadex G50柱层析,除去游离荧光素。 5)分装,4℃避光保存备用。 3.藻红蛋白标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体(25mg/hm1)、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂( SPDPH和SMCC):SPDP[3-(2- pyridyl thio) propionic acid N-hydroxysuccinimide ester] SMCC [succ inimidyltrans-4-(N-male imidylmethy cyclohexane-l- carbox late(注:SPDP用甲醇配成1.3mg/m浓度,SMCC用甲醇 配成1.πmg/m浓度备用)、77mg/ml二硫苏糖醇(DTT)、O.lmMN-乙基顺丁烯 二酰亚胺( N-ethy male imide,NEM)、不含Ca2、Mg2+的PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25柱和 Sephacryl S-300柱等。 (2)操作步骤 1)取0.25ml保存在60%(NH)SO4中的PE(4mg/mnl),经离心弃掉上清, 并用025 mI PBs重悬。 2)将上述重悬的PE溶液在室温下用150 mI PBS透析30min,期间换液两次 3)调整透析后的PE溶液浓度在14mgm(共约有0.7ml体积),加入16μul SPDP,室温孵育2~3h。 4)取纯化的抗体lm(2.5mg/ml),加入20μ I SMCC溶液,室温孵育1h, 制备SMCC-抗体交联物。 5)加入30山lDTT溶液到第三步交联好的SPDP-PE中,室温孵育30min。 6)用 Sephadex g25柱层析纯化SPDP-PE和SMCC-抗体交联物。（2）操作步骤 1）称取 1g RB200 和 2g PCl5（五氯化磷）于研钵中仔细研磨 5min 后加入 10ml 无水乙醇不断搅拌 5min，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体 标记。（注：RB200 可在 PCl5 的作用下转变成磺酰氯 SO2Cl，后者在碱性条件下 可与蛋白质的 ε-氨基结合从而实现对抗体的标记。） 2）取抗体（浓度一般在 20mg/ml 左右）适量，按照每 ml 抗体各加入 1ml 生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入 0.1ml RB200 溶液,边加边 搅拌。 3）0～4℃结合 12～18h，再用生理盐水透析 5～7h。 4）经 Sephadex G50 柱层析，除去游离荧光素。 5）分装，4℃避光保存备用。 3．藻红蛋白标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体（2.5mg/ml）、纯化过的藻红蛋白、异 双功能试剂（SPDPH 和 SMCC）：SPDP[3-（2-pyridyldithio）propionic acid N-hydroxysuccinimide ester]、SMCC [succinimidyltrans-4-（N-maleimidylmethy） cyclohexane-1-carboxlate]（注：SPDP 用甲醇配成 1.3mg/ml 浓度，SMCC 用甲醇 配成 1.7mg/ml 浓度备用）、77mg/ml 二硫苏糖醇（DTT）、0.1mM N-乙基顺丁烯 二酰亚胺（N-ethy maleimide，NEM）、不含 Ca2＋、Mg2＋的 PBS、甲醇、DMSO、 Sephadex G25 柱和 Sephacryl S-300 柱等。 （2）操作步骤 1）取 0.25ml 保存在 60％(NH)4SO4 中的 PE（4mg/ml），经离心弃掉上清， 并用 0.25ml PBS 重悬。 2）将上述重悬的 PE 溶液在室温下用 150ml PBS 透析 30min，期间换液两次。 3）调整透析后的 PE 溶液浓度在 1.4mg/ml（共约有 0.7ml 体积），加入 16µl SPDP，室温孵育 2～3h。 4）取纯化的抗体 1ml（2.5mg/ml），加入 20µl SMCC 溶液，室温孵育 1h， 制备 SMCC-抗体交联物。 5）加入 30µl DTT 溶液到第三步交联好的 SPDP－PE 中，室温孵育 30min。 6）用 Sephadex G25 柱层析纯化 SPDP－PE 和 SMCC-抗体交联物