7)将纯化后的 SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合,4℃振荡过夜 8)加入80μ的0.lmMN-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30min,终止 反应 9)利用 Sephacryl-300柱层析分离纯化PE标记的抗体,用PBS洗脱,收 集第一个洗脱峰。 10)分装,4℃避光保存备用 4.四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 (1)所需试剂与设备:纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01MPBS (pH80)、DMSO、pH9-9.5的碳酸盐缓冲液(同前)、透析袋、Bio-GelP-6层 析柱等。 (2)操作步骤 1)取1om抗体(6mgm)入透析袋在pH9-95的碳酸盐缓冲液中透析过 夜,将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2)称取四甲基异硫氰酸罗丹明lmg,用DMSO溶解制成浓度为lmgm的 溶液。 3)取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300u逐滴加入到透析过的抗体溶液 中,室温下避光搅拌2h 4)Bio-GelP6层析柱,用PBS洗脱,收集先流出的红色结合物。 5)分装,4℃避光保存备用 (二)免疫荧光细胞化学染色方法 直接法 (1)染色:给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体,在室温或37℃孵育30min。染色的整个过程,切片应被放置在湿盒中。 (2)洗片:首先倾倒掉存留的荧光抗体,然后用pH7.2或pH74的0.01M BS洗涤两次,每次5min,最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 (3)用50%缓冲(0.5M的磷酸盐缓冲液,pH9~95)甘油封固玻片,镜 检 2.间接法 常用的间接法主要有两种:双层法和夹心法。7）将纯化后的 SPDP-PE 和 SMCC-抗体交联物混合，4℃振荡过夜。 8）加入 80µl 的 0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育 30min，终止 反应。 9）利用 Sephacryl S-300 柱层析分离纯化 PE 标记的抗体，用 PBS 洗脱，收 集第一个洗脱峰。 10）分装，4℃避光保存备用。 4．四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备 （1）所需试剂与设备：纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.01M PBS （pH 8.0）、DMSO、pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液（同前）、透析袋、Bio-Gel P-6 层 析柱等。 （2）操作步骤 1）取 10ml 抗体（6mg/ml）入透析袋在 pH 9-9.5 的碳酸盐缓冲液中透析过 夜，将透析后的抗体转移自一小烧杯中。 2）称取四甲基异硫氰酸罗丹明 1mg，用 DMSO 溶解制成浓度为 1mg/ml 的 溶液。 3）取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液 300µl 逐滴加入到透析过的抗体溶液 中，室温下避光搅拌 2h。 4）Bio-Gel P-6 层析柱，用 PBS 洗脱，收集先流出的红色结合物。 5）分装，4℃避光保存备用。 （二）免疫荧光细胞化学染色方法 1．直接法 （1）染色：给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记 抗体，在室温或 37℃孵育 30min。染色的整个过程，切片应被放置在湿盒中。 （2）洗片：首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用 pH 7.2 或 pH 7.4 的 0.01M PBS 洗涤两次，每次 5min，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。 （3）用 50％缓冲（0.5M 的磷酸盐缓冲液，pH 9～9.5）甘油封固玻片，镜 检。 2．间接法 常用的间接法主要有两种：双层法和夹心法