还原法原理为：肽链C末端氨基酸可被氧硼化锂还原成相应的α氨基醇，肽链完全 水解后，此α氨基醇可用层析法鉴定，从而确定C末端氨基酸的种类。 3。拆开一硫键并分离出每条名肽裤 如果蛋白质分子是由几条不同的多肽链构成的，则必需把这些多肽链拆开并单独分 离开来，以使测定每条多肽链的氨基酸顺序。拆开二硫键最常用的方法是用过甲酸（ 过氧化氢+甲酸)将二硫键氧化，或用过量的B-巯基乙醇处理，将二硫健还原。还原法 应注意用碘乙酸（烷基化试剂）保护还原生成的半胱氨酸中的巯基，以防止二硫键的重 新生成。例如胰岛素经硫基乙醇还原后分子中三对二硫罐被拆开，两条链被分开，再用 碘乙酸保护，得到A链和B链的羧甲基衍生物，并且不会重新氧化生成二硫健。拆开 硫链以后形成的肽链可用层析 电泳等方法进行分离 HCOOOH SO; HSCH.CH.OH SH S-CH,COOH ICH:-COOH SH S-CH.COOH 4.分析每条多肽链的N末端和C末端残基 取每条多肽链的部分样品进行N末端和C末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要的氨 基酸顺序参考点。方法如前所述」 5。用两种不同方法将肽裤专性地水解成两套肽段并讲行分离 将每条多肽链用两种不同方法进行部分水解 这是一级结构测定中的关键步骤。目 前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在10 个残基以上，因此必须设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸顺序。 水解肽链的方法可采用酶法或化学法，通常是选择专一性很强的蛋白酶来水解。如胰蛋 白酶专一性地水解由碱性氨基酸（赖氨酸或精氨酸）的羧基参与形成的肽键，胰凝乳蛋 白酶专一性地水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸 色氨酸、 酪氨酸)的羧基参与形成的肽键 除了酶法之外，还可以用化学方法部分水解肽链 例如用溴化氰处理时，只有甲 氨酸的羧基参与形成的肽键发生断裂。根据肽链中甲硫氨酸残基的数目就可以估计多肽 链水解后可能产生的肽段的数目。 多肽链经部分水解后产生的长短不一的肽段可以用层析或电泳的方法加以分离，提 纯，由于不同方法水解肽链的专一性不同，所以用两种方法水解肽链后，可以得到两套 不同的肽段，便于拼凑出完整肽链的氨基酸顺序 31 31 还原法原理为：肽链 C-末端氨基酸可被氢硼化锂还原成相应的α-氨基醇，肽链完全 水解后，此α-氨基醇可用层析法鉴定，从而确定 C-末端氨基酸的种类。 3．拆开二硫键并分离出每条多肽链 如果蛋白质分子是由几条不同的多肽链构成的，则必需把这些多肽链拆开并单独分 离开来，以便测定每条多肽链的氨基酸顺序。拆开二硫键最常用的方法是用过甲酸（即 过氧化氢＋甲酸）将二硫键氧化，或用过量的β-巯基乙醇处理，将二硫键还原。还原法 应注意用碘乙酸（烷基化试剂）保护还原生成的半胱氨酸中的巯基，以防止二硫键的重 新生成。例如胰岛素经巯基乙醇还原后分子中三对二硫键被拆开，两条链被分开，再用 碘乙酸保护，得到 A 链和 B 链的羧甲基衍生物，并且不会重新氧化生成二硫键。拆开二 硫键以后形成的肽链可用层析、电泳等方法进行分离。 4．分析每条多肽链的 N-末端和 C-末端残基 取每条多肽链的部分样品进行 N-末端和 C-末端氨基酸的鉴定，以便建立两个重要的氨 基酸顺序参考点。方法如前所述。 5．用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离 将每条多肽链用两种不同方法进行部分水解，这是一级结构测定中的关键步骤。目 前用于顺序分析的方法一次能测定的顺序都不太长，然而天然的蛋白质分子大多在 100 个残基以上，因此必须设法将多肽断裂成较小的肽段，以便测定每个肽段的氨基酸顺序。 水解肽链的方法可采用酶法或化学法，通常是选择专一性很强的蛋白酶来水解。如胰蛋 白酶专一性地水解由碱性氨基酸（赖氨酸或精氨酸）的羧基参与形成的肽键，胰凝乳蛋 白酶专一性地水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）的羧基参与形成的肽键。 除了酶法之外，还可以用化学方法部分水解肽链，例如用溴化氰处理时，只有甲硫 氨酸的羧基参与形成的肽键发生断裂。根据肽链中甲硫氨酸残基的数目就可以估计多肽 链水解后可能产生的肽段的数目。 多肽链经部分水解后产生的长短不一的肽段可以用层析或电泳的方法加以分离，提 纯，由于不同方法水解肽链的专一性不同，所以用两种方法水解肽链后，可以得到两套 不同的肽段，便于拼凑出完整肽链的氨基酸顺序