6.测定各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序 多肽链部分水解后分离得到的各个肽段需进行氨基酸推列顺序的测定，序列测定可 用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸顺序 进行比较分析 根据交叉重叠部分的顺序推导出完整肽链的氨基酸顺序 比如有 质肽链的一个片段为十肽，用两种方法水解，水解法A得到四个小肽，分别为A:Ala-Phe: A2:Gly-Lys-Asn-TyT:A:Ag-TyT:A4:His-Val。水解法B得到三个小肽，分别为B1: Ala-Phe-Gy-Lys:B2:Asn-yr-Arg:B:Tyr-His-al。将两套肽段进行比较分析得出如下 结果， 氨基酸顺序 A。 Ala-Phe Ala-Phe-Gly-Lys Gly-Lys-Asn-Tyr 8 Asn-Tyr-Arg A Arg-Tyr 马 Tyr-His-Val A His-Val 十顺序 Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr-His-Val 7.二疏键位置的确定 蛋白质分子中二硫键位置的确定也是以氨基酸的测序技术为基础的。这一先聘往往 在确定了蛋白质的氨基酸顺序后再进行。 :根据已知氨基酸顺序选择合 的专一性蛋白水解酶 在不打开 硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的肽段过 行分离。将分离得到的含有二硫键的肽段进行氧化或还原，切断二硫健。分离切断二所 键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的氨基酸顺序 与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。 应用种方法 Sanger等人于1953年完成了第一个蛋白质牛胰岛素一级结构的 测定。胰岛素是动物胰脏 中胰岛细胞分泌的 一种激素蛋白，其功能是调节糖代谢。胰 素分子由51个氨基酸残基组成，分子量为5734，由A、B两条肽链组成，A链含21 氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基。A链和B链通过两个二硫健连接在一起，在A链 内部还有一个二硫键，图20为胰岛素的氨基酸顺序。我国生化工作者根据胰岛素的氨 基酸顺序于1965年用人工方法成功地合成了具有生物活性的胰岛素，第一次成功地完成 了蛋白质的全合成。 3232 6．测定各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序 多肽链部分水解后分离得到的各个肽段需进行氨基酸排列顺序的测定，序列测定可 用氨基酸序列分析仪。然后用重叠顺序法将两种水解方法得到的两套肽段的氨基酸顺序 进行比较分析，根据交叉重叠部分的顺序推导出完整肽链的氨基酸顺序。比如有一蛋白 质肽链的一个片段为十肽，用两种方法水解，水解法 A 得到四个小肽，分别为 Al：Ala-Phe； A2：Gly-Lys-Asn-Tyr；A3：Arg-Tyr；A4：His-Val。水解法 B 得到三个小肽，分别为 B1： Ala-Phe-Gly-Lys；B2：Asn-Tyr-Arg；B3：Tyr-His-Val。将两套肽段进行比较分析得出如下 结果： 肽 氨 基 酸 顺 序 A1 Ala-Phe B1 Ala-Phe-Gly-Lys A2 Gly-Lys-Asn-Tyr B2 Asn-Tyr-Arg A3 Arg-Tyr B3 Tyr-His-Val A4 His-Val 十肽顺序 Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr-His-Val 7．二硫键位置的确定 蛋白质分子中二硫键位置的确定也是以氨基酸的测序技术为基础的。这一步骤往往 在确定了蛋白质的氨基酸顺序后再进行。其基本步骤是：根据已知氨基酸顺序选择合适 的专一性蛋白水解酶，在不打开二硫键的情况下部分水解蛋白质，将水解得到的肽段进 行分离。将分离得到的含有二硫键的肽段进行氧化或还原，切断二硫键。分离切断二硫 键以后生成的两个肽段，并确定这两个肽段的氨基酸顺序。将这两个肽段的氨基酸顺序 与多肽链的氨基酸顺序比较，即可推断出二硫键的位置。 应用这种方法，Sanger 等人于 1953 年完成了第一个蛋白质 牛胰岛素一级结构的 测定。胰岛素是动物胰脏中胰岛细胞分泌的一种激素蛋白，其功能是调节糖代谢。胰岛 素分子由 51 个氨基酸残基组成，分子量为 5 734，由 A、B 两条肽链组成，A 链含 21 个 氨基酸残基，B 链含 30 个氨基酸残基。A 链和 B 链通过两个二硫键连接在一起，在 A 链 内部还有一个二硫键，图 2-10 为胰岛素的氨基酸顺序。我国生化工作者根据胰岛素的氨 基酸顺序于 1965 年用人工方法成功地合成了具有生物活性的胰岛素，第一次成功地完成 了蛋白质的全合成