2.拟采用的研究方法,技术路线,实验方案及可行性分析 研究方法,技术路线,实验方案 1)筛查比较慢性宫颈慢性疾病、宫颈癌前病变、宫颈癌的病变特点与HPV感染关系 (1)计算机智能( Tenet)筛查上述三类病变细胞涂片 (2)电子阴道镜观察病变特点 (3)检查各类病变HV感染状态,分析HPV各亚群与特定宫颈病变的相互关系(PCR和 荧光免疫方法) 2)宫颈癌细胞HPV致病DN正向示踪分析: (1)分离克隆宫颈癌细胞的表达差异DNA(对照正常周边组织细胞) (2)抑制性消减杂交技术和差异显示PCR筛查 (3)RT-PCR合成相应mRNA并通过荧光标记制成生物探针 (4)应用PCR单链构象多态性分析法( PCR-SSCP)和PCR杂合双链分析法( PCR-HA)检测 可能诱发的突变基因;a)通过PCR-SSCP法在中性聚丙烯酰胺凝胶上分析DNA 的二级结构的变化,从而显示相应小片段碱基的改变:b) PCR-HA法采用异源杂 合双链错位配处手段分析相应同源双链DNA的迁移率,进而显示突变片段 (5)应用表达谱基因芯片杂交分析待查基因在宫颈癌细胞的差异表达,进而阐明基 (6)分析鉴定相应蛋白在组织细胞中的差异表达 )宫颈癌细胞HPV致病蛋白逆向求源分析: (1)宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白一级分析:应用 Western blot和原位杂交粗筛差 异表达蛋白; (2)宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白二级分析:应用二维蛋白显示( Protein2-D eletrophoresis)对时一级分析筛选的目标蛋白进行精细分带,与对照组织细胞表达 蛋白进行差异分析 (3) Raman光谱分析:样品经特殊处理进行 Raman光谱分析,利用特征振动谱带信 息指认蛋白的功能基团的成份及活性、蛋白质二级结构(α-Hlix、β-shet Radon Coil,及C=O、C+N伸张、N-H弯曲指认和归属等),以此弄清差异表达蛋 白的功能基团和蛋白质二级结构。⎯ 5-1 ⎯ 2. 拟采用的研究方法，技术路线，实验方案及可行性分析 研 究 方 法 ， 技 术 路 线 ， 实 验 方 案 1） 筛查比较慢性宫颈慢性疾病、宫颈癌前病变、宫颈癌的病变特点与HPV感染关系： (1) 计算机智能(Pepnet)筛查上述三类病变细胞涂片； (2) 电子阴道镜观察病变特点； (3) 检查各类病变HPV感染状态，分析HPV各亚群与特定宫颈病变的相互关系(PCR和 荧光免疫方法)。 2) 宫颈癌细胞HPV致病DNA正向示踪分析： (1) 分离克隆宫颈癌细胞的表达差异DNA(对照正常周边组织细胞) ； (2) 抑制性消减杂交技术和差异显示PCR筛查； (3) RT-PCR合成相应mRNA并通过荧光标记制成生物探针； (4) 应用PCR单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)和PCR杂合双链分析法(PCR-HA)检测 可能诱发的突变基因； a) 通过PCR-SSCP法在中性聚丙烯酰胺凝胶上分析DNA 的二级结构的变化，从而显示相应小片段碱基的改变；b) PCR-HA法采用异源杂 合双链错位配处手段分析相应同源双链DNA的迁移率，进而显示突变片段； (5) 应用表达谱基因芯片杂交分析待查基因在宫颈癌细胞的差异表达，进而阐明基 因功能； (6) 分析鉴定相应蛋白在组织细胞中的差异表达。 3) 宫颈癌细胞HPV致病蛋白逆向求源分析： (1) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白一级分析: 应用Western Blot和原位杂交粗筛差 异表达蛋白； (2) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白二级分析: 应用二维蛋白显示(Protein 2-D eletrophoresis) 对一级分析筛选的目标蛋白进行精细分带，与对照组织细胞表达 蛋白进行差异分析； (3) Raman光谱分析：样品经特殊处理进行Raman光谱分析，利用特征振动谱带信 息指认蛋白的功能基团的成份及活性、蛋白质二级结构(--Helix、--sheet Radon Coil及C=O、C+N伸张、N-H弯曲指认和归属等)，以此弄清差异表达蛋 白的功能基团和蛋白质二级结构