(9)PBS洗涤三次,每次2min (10)显色:HRP标记抗体的显色剂为含有0.01-0.1%H202、001-0.05%DAB、 001-0. IM Tris-HCI(pH74)的缓冲液。切片经PBS漂洗后,在室温黑暗条件下 置入上述显色液中显色,镜检控制显色时间与速度 (11)流水或PBS终止显色 (12)系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固、镜检。 (二)非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由 Sternberger等在酶标法的基础上发展而成,能有效降低 背景,能最大程度保留抗体的活性,灵敏度高。主要有酶桥法(ε nzy me bridge method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法( peroxidase antiperoxidase method,PAP), 又以后者的应用较为广泛 这两种方法均需先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体,然后 在第二抗体(亦称桥抗体)的作用下,将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第 一抗体连结起来,进而再将酶结合在抗酶抗体,最后经呈色反应来显示抗原的分 布。所不同的是,在PAP法中,通常先让抗酶抗体与酶形成复合物(如PAP复 合物),然后在桥抗体的帮助下,一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中,任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, 避免了共价连结对抗体和酶活性的损害,同时还提高了方法的敏感性,且能节省 第一抗体的用量 1.PAP的制备在离体条件下制备HRP与抗HRP的复合物(PAP复合物) 的主要步骤如下。 (1)按常规免疫学方法制备抗HRP血清。 (2)制备PAP复合物。所需试剂包括:1mg/ ml HRP溶液、2mg/ mlHRP溶 液、生理盐水、O. IMHCI、 IMHCI、0. IMNaOH、 IMNaOH、饱和硫酸铵溶液 50%硫酸铵溶液、透析液(486 g Nacl,1,5 MNaoocch3oml,1,5M(NH4)SO 30ml,水594L)等:其步骤为 1)取10.50m抗HRP血清,加760 ml HRP水溶液(lmg/ml),混匀后,室 温放置1h。 2)4℃,16000g离心15min,小心弃掉上清。（9）PBS 洗涤三次，每次 2min。 （10）显色：HRP 标记抗体的显色剂为含有 0.01-0.1%H202、0.01-0.05%DAB、 0.01-0.1M Tris-HCl（pH7.4）的缓冲液。切片经 PBS 漂洗后，在室温黑暗条件下 置入上述显色液中显色，镜检控制显色时间与速度。 （11）流水或 PBS 终止显色。 （12）系列乙醇脱水、Hemo-De 透明、DPX 封固、镜检。 （二）非标记抗体酶法 非标记抗体酶法由 Sternberger 等在酶标法的基础上发展而成，能有效降低 背景，能最大程度保留抗体的活性，灵敏度高。主要有酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method, PAP）， 又以后者的应用较为广泛。 这两种方法均需先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后 在第二抗体（亦称桥抗体）的作用下，将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第 一抗体连结起来，进而再将酶结合在抗酶抗体，最后经呈色反应来显示抗原的分 布。所不同的是，在 PAP 法中，通常先让抗酶抗体与酶形成复合物（如 PAP 复 合物），然后在桥抗体的帮助下，一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。 在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合， 避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，同时还提高了方法的敏感性，且能节省 第一抗体的用量。 1．PAP 的制备 在离体条件下制备 HRP 与抗 HRP 的复合物（PAP 复合物） 的主要步骤如下。 （1）按常规免疫学方法制备抗 HRP 血清。 （2）制备 PAP 复合物。所需试剂包括：1mg/ml HRP 溶液、2mg/ml HRP 溶 液、生理盐水、0.1M HCl、1M HCl、0.1M NaOH、1M NaOH、饱和硫酸铵溶液、 50％硫酸铵溶液、透析液（48.6g NaCl, 1.5M NaOOCCH3 30ml, 1.5M (NH4)2SO4 30ml, 水 5.94L）等；其步骤为： 1）取 10.50ml 抗 HRP 血清，加 7.60ml HRP 水溶液（1mg/ml），混匀后，室 温放置 1h。 2）4℃，16000g 离心 15min，小心弃掉上清