3)用预冷的生理盐水溶解沉淀,4℃,16000g离心15min,重复4次。 4)加15、3 ml HrP水溶液(2mg/ml),室温,持续搅拌Ih 5)用1MHCl及0. IM HCI调p至2.3,沉淀物全部溶解变清,立即用IM 及0. MNaOh调pH至72。 6)慢慢加等体积的饱和硫酸铵,O℃放置45min 7)0℃,35000g离心15min,所得沉淀用50%硫酸铵洗涤两次 8)用10.50ml水溶解沉淀,置入透析袋中4℃透析过夜。 9)4℃离心,收集上清,加适量透析液使体积至10.50ml,分装后于4℃保 2.PAP染色方法染色步骤包括:①切片准备及第一抗体孵育前处理步骤 同酶标抗体染色间接法的1~5步;②切片与特异性一抗4℃孵育24h;③用过量 的桥抗体孵育;④用离体制得的PAP复合物(常作1:30~300稀释)室温下孵 育1~1.5h,使其能够被桥抗体连结在第一抗体上;⑤用DAB-H2O2液显色,镜 下控制显色程度;⑥系列酒精脱水,二甲苯透明,DPⅹ封固,镜检 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用,一些新的技术创新也不断涌现。其中最 具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素( lectin)、生物 素( biotin)和葡萄球菌A蛋白( staphylococcal protein A,SPA)等被应用于免 疫细胞化学技术,从而建立了SPA-HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等一 些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、 氧化和还原,另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此, Bayer在1976 年将其命名为亲合组织化学( affinity histochemistry)。 目前,亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌 A蛋白与IsG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用,所以,抗原抗体反应 亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学 的敏感性得到进一步提高,更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原(或抗体) 的定位进行研究 现以抗生物素生物素免疫细胞化学染色为例,简要介绍亲和组织化学技术。3）用预冷的生理盐水溶解沉淀，4℃，16000g 离心 15min，重复 4 次。 4）加 15.3ml HRP 水溶液（2mg/ml），室温，持续搅拌 1h。 5）用 1M HCl 及 0.1M HCl 调 pH 至 2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用 1M 及 0.1M NaOH 调 pH 至 7.2。 6）慢慢加等体积的饱和硫酸铵，0℃放置 45min。 7）0℃，35000g 离心 15min，所得沉淀用 50%硫酸铵洗涤两次。 8）用 10.50ml 水溶解沉淀，置入透析袋中 4℃透析过夜。 9）4℃离心，收集上清，加适量透析液使体积至 10.50ml，分装后于 4℃保 存。 2．PAP 染色方法 染色步骤包括：①切片准备及第一抗体孵育前处理步骤 同酶标抗体染色间接法的 1～5 步；②切片与特异性一抗 4℃孵育 24h；③用过量 的桥抗体孵育；④用离体制得的 PAP 复合物（常作 1:30～300 稀释）室温下孵 育 1～1.5h，使其能够被桥抗体连结在第一抗体上；⑤用 DAB-H2O2 液显色，镜 下控制显色程度；⑥系列酒精脱水，二甲苯透明，DPX 封固，镜检。 五、亲合组织化学 随着免疫组织化学方法的广泛应用，一些新的技术创新也不断涌现。其中最 具代表性的就是一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（lectin）、生物 素（biotin）和葡萄球菌 A 蛋白（staphylococcal protein A，SPA）等被应用于免 疫细胞化学技术，从而建立了 SPA-HRP 法、ABC 法、BRAB 法和 LAB 法等一 些新的细胞组织化学技术。这些技术一方面区别于古老的组织化学的分解、置换、 氧化和还原，另一方面在本质上又不属于抗原抗体反应。因此，Bayer 在 1976 年将其命名为亲合组织化学（affinity histochemistry）。 目前，亲合组织化学包括植物凝集素与糖类、抗生物素与生物素、葡萄球菌 A 蛋白与 IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 由于抗原与抗体的相互作用从本质上讲也是一种亲和作用，所以，抗原抗体反应 亦属于亲和组织化学范畴。亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使得免疫细胞化学 的敏感性得到进一步提高，更有利于在细胞或亚细胞水平对微量抗原（或抗体） 的定位进行研究。 现以抗生物素-生物素免疫细胞化学染色为例，简要介绍亲和组织化学技术