不能从酶活性部位向周围组织弥散,而影响组织学定位;⑤酶与抗体的连接不能 影响抗体的活性;⑥在被检测的细胞或组织中,不能存在与标记酶相同的内源性 酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase HRP)、碱性磷酸酶( alkaline phosphatase,ALP)、葡萄糖氧化酶( glucose oxidase GOD)等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同,它需借助偶联剂的作用将酶 链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、 male im ide等。这些偶 联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用,因而是不可逆的,同时,偶联剂的加 入还应不影响酶和抗体的活性,不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非 特异性结合。 2.染色方法酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种,以间接法为 主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 (1)细胞组织切(涂、爬)片的准备与固定 (2)用PBS或其他缓冲液洗涤切片三次,每次2min,溶解除去冰冻切片上 的OCT包埋剂。(但当应用ALP标记的抗体时,应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤, 因为后者可使ALP失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步)。 (3)根据需要,用甲醇+0.3%过氧化氢处理切片15~30min,封闭内源性 氧化酶的作用,PBS洗涤两次,每次2min。(应用ALP标记的抗体时可省略此 过程)。 (4)在室温条件下,将切片放入到含005% Tween-20的PBS缓冲液中处理 5min,以增强组织的通透性 (5)用4%的 Block ace或0.01%~1%的BSA在适合中孵育切片15~25min, 以阻断抗体与组织的非特应性结合。 (6)轻轻弃掉上述孵育液,根据需要滴加含0.2%BSA,005%NaN3的经 PBS稀释的一抗。通常,每片滴加50~80μu,室温下湿盒中孵育1~2h,免疫电 镜标本需要在4℃下过夜。(注:此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染)。 (7)PBS洗涤三次,每次2min,以除去非特异性结合的吸附抗体 (8)用含005% TWeen-20的PBS缓冲液洗涤2min后,滴加含0.2%BSA, 1%正常血清的经PBS稀释的HRP酶标二抗,室温下湿盒内孵育45~60min不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位；⑤酶与抗体的连接不能 影响抗体的活性；⑥在被检测的细胞或组织中，不能存在与标记酶相同的内源性 酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase， GOD）等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同，它需借助偶联剂的作用将酶 链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、maleimide 等。这些偶 联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用，因而是不可逆的，同时，偶联剂的加 入还应不影响酶和抗体的活性，不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非 特异性结合。 2．染色方法 酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种，以间接法为 主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。 （1）细胞组织切（涂、爬）片的准备与固定。 （2）用 PBS 或其他缓冲液洗涤切片三次，每次 2min，溶解除去冰冻切片上 的 OCT 包埋剂。（但当应用 ALP 标记的抗体时，应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤， 因为后者可使 ALP 失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步）。 （3）根据需要，用甲醇＋0.3%过氧化氢处理切片 15～30min，封闭内源性 氧化酶的作用，PBS 洗涤两次，每次 2min。（应用 ALP 标记的抗体时可省略此 过程）。 （4）在室温条件下，将切片放入到含 0.05%Tween-20 的 PBS 缓冲液中处理 5min，以增强组织的通透性。 （5）用4％的Block Ace或0.01%～1%的BSA在适合中孵育切片15～25min， 以阻断抗体与组织的非特应性结合。 （6）轻轻弃掉上述孵育液，根据需要滴加含 0.2%BSA，0.05% NaN3 的经 PBS 稀释的一抗。通常，每片滴加 50～80µl，室温下湿盒中孵育 1～2h，免疫电 镜标本需要在 4℃下过夜。（注：此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染）。 （7）PBS 洗涤三次，每次 2min，以除去非特异性结合的吸附抗体。 （8）用含 0.05%Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 2min 后，滴加含 0.2%BSA， 1％正常血清的经 PBS 稀释的 HRP 酶标二抗，室温下湿盒内孵育 45～60min