2 J Bengbu Med Coll,January 2011,Vol.36,No.1 Oxl)在肝癌MDR中的作用机制，为临床合理使用 TGA AGG ACT TCG TGT CAG CC-3',antisense:5' 化疗方案及逆转剂提供理论基础。 GTC CAT GAT GGT CTT GAG CC-3'(扩增片段为 256 bp):BCRP sense:5'-CAG GTG GAG GCA AAT 1材料与方法 CTT CGT-3'antisense.5'-ACA CAC CAC GGA TAA 1.1仅器和试剂(1)细胞林：H©pG2细胞购于中 ACT GA-3(扩增片段为315p):GAPDH ense:5' 科院细胞研究所，不同浓度的HepG2/Oxal耐药细 CCC AAG GTG AAG GTC CG AGT C-3',antisense: 胞株由本实验室建立。于10%胎牛血清的DEM 5'-ACC ACA CCC CGC AGA GAT GAT-3'(扩增片 培养基中37℃，5%体积分数C02条件下培养。 段为375bp)。PCR反应体系为50 pl:cDNA10l, (2)主要试剂奥沙利铂干美国Sma公司，相对 引物浓度为50nm0/L.Ta酶1u。反应条件.94 分子质量为39729：DMEM培养基和胰酶均购自 1,94℃变性458,63℃退火30s,72℃延件 Gib公司：TT由上海华舜生物有限工程公司生 1min,共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR 产。RNA反转录试剂盒购于Ferment公司。兔抗人 反应结束后，取5u!物于2.0%琼脂糖凝胶中电 乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, 泳，用Bio-Rad凝胶成像系统扫描并测定灰度值，判 BCRP)多药耐药相关蛋白（muli-drue resistanc 断耐药相关基因在亲本及不同耐药亚系中的表达水 related protein,MRP)、3-磷酸甘油醛脱氢砖 (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH 1.2.4 m blot检测亲本及不同耐药亚系中耐 -抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔和大鼠抗小鼠多 药相关基因蛋白的表达分别收集对数生长期的亲 克隆抗体均购自北京中杉生物技术有限公司。ECL 本细胞2.5、5.0g/m耐药亚系的细胞，用细胞裂 发光试剂盒购自Amersham公司，Vestern blot法使 解液提取各细胞总蛋白，Bamd-fod法则定总蛋白 用的PVDF膜购于Millipore公司；预染标准分子量 g总蛋白进行I2%SDS-PAGE凝胶电 蛋白购自CIBCO/.BRL公司。 泳，电泳后转到PVDF膜。室温封闭】 h,分别加 1.2方法 抗人的(BCRP、MDR,MRP)一抗，抗体工作浓度为 1.2.1时药细腹株的球立采用浓度梯度透导法 1:200.GAPDH作为内参，于4℃解奋寸夜。TBS 律立2.5,5.0/ml浓度的奥沙利铂时药细胞株 Tween20缓冲液洗膜10min×3次.加入1：4000稀 HepG2/Oxal诱导按文献[2]将Oxal浓度递增诱导 释辣根过氧化物酶标记的偶联二抗室温温育1h: 至5g/m的DMEM培养基中维持生长：成功获得 BS ween20缓冲液洗膜10min×3次。加人ECl 2.5,5.0gml浓度下稳定耐药的细胞株，并在该 液在Bio-RAD成像分析系统上成像并进行密度分 浓度药物压力下稳定牛长 析，表示3种耐药蛋白的相对表达水平。 1.2.2耐药性的测定HpG2细胞在含10%的胎 1.3统计学方法采用方差分析和口检验 牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO, 和湿度的培养箱内培养 取对数生长期细胞，不同 2 结果 浓度的Oxal分别加人HepG2和HepG2/Oxl中作 2.】HepG2/Oxal性状测定耐药细胞和亲本细胞 用48后TT法测A值，重复3次取其平均值.计 的形态差异较大，且生长速度变慢。MTT法测定发 算细胞生存率=(A实验组一A空白组)/(A对照 现5.0ug/ml HepG2/0xal细胞对Oxal的1C50是 组-A空白组)×100%。根据细胞生存率绘制细胞 2.5:2.5 g/ml HepG2/0xal细胞对Oxdl的IC50 +算1C50 为7.71： epG2细胞对0xa 的 是0.49 RT-PCR检测亲本及不同浓度耐药亚系中 5.0 g/ml HepG2/Oxal耐药亚系细胞IC50是亲本 BCRP,MDR和MRP mRNA表达水平取对数生长 的25倍；2.5g/ml HepG2/0xal耐药亚系的1C50 期的亲本及2.5、5.0山/ml耐药亚系细胞，细胞 是亲本的15倍（见表1）。 RNA提取参照Tiol试剂说明书进行：cDNA合成 2.2亲本及不同耐药亚系中耐药相关基因mRN 参照Fem t公司的反转录试剂盒合成。利用引书 的表达 结果显示，在亲本H©pG2细胞与不同浓 设计软件Primer5.0设计，由上海生工生物有限公 耐药亚系HepG2/Oxal细胞中，随着耐药浓度的增 司合成。MDR sense:5'-CCC ATC ATT GCA ATA 加，BCRP mRNA的表达水平逐渐增加，各组间比较 CCA GG-3',antisense:5'-GTT CAA ACT TCT GCT 差异有统计学音义(P<O.01)。MDR MRP mRNA CCT GA-3'(扩增片段为156bp):MRP sense:5' 的表达水平也逐渐增加，但亲本和2.5g/ml耐药12 Oxa1)在肝癌 MDR中的作用机制 ，为临床合理使用 化疗方案及逆转剂提供理论基础。 1 材料 与方法 1．1 仪 器和试 剂 (1)细胞 株 ：HepG2细 胞 购于 中 科院细胞研究所 ，不同浓度 的 HepG2／Oxal耐药细 胞株由本实验室建立。于 10％胎牛血清 的 DMEM 培 养 基 中 37 oC、5％ 体 积 分 数 CO，条 件 下 培 养 。 (2)主要试 剂 ：奥沙 利 铂 购 于美 国 Sigma公 司 ，相 对 分子 质 量 为 39729；DMEM 培 养 基 和 胰 酶 均 购 自 Gibco公 司 ；MTT由上 海 华 舜 生 物 有 限 【程 公 司生 产。RNA反转录试剂盒购于 Ferment公司。兔抗人 乳腺 癌 耐 药 蛋 白 (breastcancerresistanceprotein， BCRP)、多 药 耐 药 相 关 蛋 白 (multi—drugresistance related protein，MRP)、3一磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 (glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH) 一 抗 、辣根过氧化物酶标记羊抗兔和大 鼠抗小 鼠多 克隆抗体均购 自北京中杉生物技术有限公司。ECL 发光试剂盒购 自 Amersham公 司，Westernblot法使 用 的 PVDF膜购 于 Millipore公 司 ；预 染 标准 分 子 量 蛋 白购 自 GIBCO／BRL公 司 。 1．2 方 法 1．2．1 耐药细胞株的建立 采用浓度梯度诱导法 建立 2．5、5．0txg／ml浓 度 的 奥 沙利 铂 耐 药 细胞 株 ； HepG2／Oxal诱导按文献 [2]将 Oxal浓度递增诱导 至 5 ml的 DMEM培养基中维持生长；成功获得 2．5、5．0 g／ml浓 度 下稳 定 耐 药 的 细胞 株 ，并 在 该 浓度药 物压力 下稳定 生长 。 1．2．2 耐药性的测定 HepG2细胞在含 10％的胎 牛血清的 DMEM培养基 中，置于 37oC、5％CO，、饱 和湿度的培养箱内培养。取对数生 长期细胞 ，不 同 浓度的 Oxa1分别加入 HepG2和 HepG2／Oxal中作 用 48h后 MTI'法测 A值 ，重复 3次取其平均值 ，计 算细胞生存率 =(A实验组 一A空 白组 )／(A对照 组 一A空 白组 )×】00％ 。根据 细胞生 存率绘 制细 胞 存活曲线 ，计算 IC50。 1．2．3 RT—PCR检测亲本及不 同浓度 耐药亚 系中 BCRP、MDR和 MRPmRNA表达水平 取对数生长 期的亲本 及 2．5、5．0Ixg／ml耐药亚 系细胞 ，细胞 RNA提取参照 Trizol试剂 说明书进行 ；cDNA合成 参照 Ferment公 司的反转录试剂盒合成。利用引物 设计软件 Primer5．0设计 ，由上海生工生物有 限公 司合 成 。MDR sense：5．CCC ATC ATI'GCA ATA GCA GG一3 ，antisense：5 一GTIP CAA ACT TCT GCT CCTGA一3 (扩 增 片段 为 156bp)；MRPsense：5一 JBengbuMedColl，January2011，Vo1．36，No．1 ’I、GA AGG AC’r I、CG TGT CAG CC一3’，antisense：5 一 GTCCAT GAT GGT GTI"GAG CC-3 (扩 增 片 段 为 256bp)；BCRP sense：5-CAG GTG GAG GCA AAT CTF CGT一3 ．antisense：5 一ACA CAC CAC GGA TAA ACTGA一3(扩增 片 段为 315bp)；GAPDH sense：5． GGG AAG GTG AAG GTC GG AGT C 一3 ，antisense： 5一AGCAGA GGG GGCAGA GAT GAT一3 (扩增 片 段为 375bp)。PCR反应体系为 50Ixl：cDNA10Ixl， 引物浓 度为 50nmol／L，Taq酶 1U。反应条 件 ：94℃ 5rain，94qC 变性 45S，63oC退 火 30S，72cc 延 伸 1min，共 35个循环 ，最后 72℃延伸 10rain。PCR 反应结束后，取 5 l产物于 2．0％琼脂糖凝胶 中电 泳 ，用 Bio—Rad凝胶成像系统扫描并测定灰度值 ，判 断耐药相关基因在亲本及不同耐药亚系中的表达水 平 。 1．2．4 Westernblot检测亲本及不同耐药亚系中耐 药相关基因蛋白的表达 分别收集对数生长期的亲 本 细胞 、2．5、5．0 g／ml耐 药亚 系 的细胞 ，用 细胞 裂 解 液提取各细胞总蛋 白，Brand—ford法测定总蛋 白 浓度 。取 40 g总蛋 白进 行 12％ SDS—PAGE凝胶 电 泳 ，电泳后转到 PVDF膜。室温封闭 1h，分别加兔 抗人的(BCRP、MDR、MRP)一抗 ，抗体工作 浓度为 1：200，GAPDH作为 内参 ，于 4℃孵 育 过夜。TBS． Tween20缓冲液洗膜 10min×3次 ，加入 1：4000稀 释辣根过氧化物酶标 记的偶联 二抗室 温温育 1h； TBS．Tween20缓 冲液 洗膜 10minX3次 。加人 ECL 液 在 Bio—RAD 成 像 分 析 系 统 上 成 像 并进 行 密度 分 析 ，表示 3种耐药蛋 白的相对表达水平。 1．3 统计 学方法 采用方差分析和 q检验。 2 结果 2．1 HepG2／Oxal性状测定 耐药细胞和亲本细胞 的形 态差 异较 大 ，且 生 长速 度 变慢 。MTI'法 测定 发 现 5．0 g／mlHepG2／Oxal细胞 对 Oxal的 IC50是 l2．5；2．5 mlHepG2／Oxal细 胞 对 Oxal的 IC50 为 7．71；HepG2 细 胞 对 Oxal的 IC50 是 0．49。 5．0 g／mlHepG2／Oxal耐药亚系细胞 IC50是亲本 的 25倍 ；2．5 mlHepG2／Oxal耐药亚 系的 IC50 是亲本的 l5倍(见表 1)。 2．2 亲本及 不 同耐 药亚 系 中耐 药相 关基 因 mRNA 的表达 结果显示 ，在亲本 HepG2细胞与不 同浓度 耐药亚系 HepG2／0xal细胞 中，随着 耐药浓度的增 加 ，BCRPmRNA的表达水平逐渐增加 ，各组间比较 差异有统计学意义(P<0．01)。MDR、MRPmRNA 的 表达水平也逐 渐增加 ，但亲本和2．5Ixg／ml耐药