蚌埠医学院学报2011年1月第36卷第1期 11 【文章编号】1000-2200(2011)010011-04 ,基础医学 多药耐药相关蛋白在肝癌耐药细胞系 HepG2/Oxal中的作用机制研究 滕凤猛，吴穷，陈昌杰，杨清玲，王惠 [摘要jg的：探讨多药耐药(muidrugresistance,MDR)相关蛋白在肝癌细胞系HepG2及不同浓度耐奥沙利铂(ptin Oxl)亚系中的表达及参与肝癌对Oxl耐药的机制。方法：以浓度递增法诱导肝癌细孢系HepC2,建立2.55.0/ml的Oal 耐药亚系，以半定量RT-PCR法测定MDR,多药耐药相关蛋自(muli-dge e related protein,MRP)和乳腺痛耐药蛋白 (breast cancer resistance protein,BCRP)在亲代和不同耐药亚系中的mRNA表达，并在蛋白水平以Wese 的差异性。结果：成功建立了1C50值为15和25倍代细胞的Oxl耐药亚系(HpG2/Oxal):在mRNA和蛋白水平，BCRP的 表达 表技与2地西益送五R心的表达东的百不用显度的润双原 BCRP在HepG2对Oal获得性耐药中起着重要作用，MDR和MRP在 度的横加麦接来越高 [关键词]肝肿痛：奥沙 腺癌耐药蛋白 [中国围书资料分类法分类号] :R979 [文献标识码】A Role of multi-drug resistance proteins in drug resistance cell line HepG2/Oxal of hepatocellular carcinoma TENG Fen ng'.WU Oiong CHEN Chang-jie'.YANG Oing-ling'WANG Hui' (1.Research Center of Clinical Iabon Bengbu Anhui 233030 [Abstract]Objective:To investigate the expression of multi-drug esiated proteins(MDR)in Hepatocellular cancer cell line HepG2 and in differenoofeline of opatin(Oxa),andtostudy the mechanis of their resistanee to Oxal. Methods:HepG2 multi-drug resistance sub-cell line was induced by increasing the concentration of Oxal progressively.and the drus ance cell line 2.5 ue/ml HepC2/Oxal and 5.0 ug/ml HenG2/Oxal was successfully established.The mRNA expression of the MDR,the expression of multi-trug resistance related protein MRP)and breast cancer resistance protein BCRP)in the cell lines HepG2/Oxal)of 2.5 ug/ml HepG2/Oxal and 5.0 ug/ml HepG2/Oxal were detected using RT-PCR,and the variability of the gen expression was verified by Westemn blot.Results.Hepc2/Oxal drug resistanee cell subseries with Ic5o value of 15 and 25 times successfully constructed.BCRP expression was positively correlated with HepC2 drug resistance at mRNA and the protein level.But MDR and MRP did not display significant high pression in the prophase drug resi ce expression of MDR and MRP reased along with the rise of drug resistance level.Conclusions:BCRP pla ortant role in the d characte HepG2 cell jine to Oxal:the ex es with the rise o the [Keywords]liverneoplasms;oxaliplatin;multi-dnugresistanceprotein;breas 肝癌为我国最常见的恶性程度极高、预后极差 者，采取消融和介人治疗等手段，虽然提高了局部 的恶性肿瘤 ·,发病率高，治疗难度大 ,手术切 ,却在延长 者的生存时间上不能令 人满总 (包括肝移植)是治愈的唯一方法：对于不能切除 晚期肝癌的系统性化疗仍有重要的临床价值，但部 分患者往往由于肝癌细胞的多药耐药(multi-.dug resistance.MDR)而导致化疗无效或涤渐由有效其 为无效。MDR的产：生与多药耐药基因、多药耐药蛋 白表达增多密切相关)。肝癌的MDR是严重影响 233030,2.蚌医学院第一附属医院肿瘤内科，安蚌 化疗效果及患者生存的主要原因。故研究肝癌对新 作者简介1 代化疗药 物的MDR产生机制，对提高屏 的化 通讯作者】陈昌态，博士.颈士研究生导师，教授，Eml:bbmccej@ 疗效果，延长患者的生存期及合理化疗方案的应用 sohu.com 有者重要的意义。因此，深讨奥沙利铂(oxaliplatin
蚌埠 医学院学报 2011年 1月第 36卷第 1期 [文章编号 ]1000—2200(2011)Ol43011-04 多药耐药相关蛋 白在肝癌耐药细胞 系 HepG2／Oxal中的作用机制研究 滕凤 猛 ，吴 穷 ，陈 昌杰 ，杨清 玲 ，王 惠 ll · 基 础 医学 · [摘要】目的：探讨多药耐药 (multi—drugresistance，MDR)相关 蛋 白在肝 癌细胞 系 HepG2及 不 同浓度 耐奥沙 利铂 (oxaliplatin， Oxa1)亚系中的表达及参与肝癌对 Oxal耐药 的机制。 方法 ：以浓度递增法诱 导肝 癌细胞 系 HepG2，建立 2．5、5．0 _／m1的 Oxal 耐药亚系 ，以半定量 RT—PCR法测定 MDR、多 药耐药 相关 蛋 白(multi—drugresistancerelatedprotein，MRP)和乳腺 癌耐 药蛋 白 (breastcancerresistanceprotein，BCRP)在 亲代和不 同耐药亚系中的 mRNA表达 ，并在蛋 白水平 以 Westernblot法验证基 因表达 的差 异性 。结果：成功建立 了 IC50值 为 15和 25倍亲代细胞 的 Oxal耐药亚系 (HepG2／Oxa1)；在 mRNA和蛋 白水平 ，BCRP的 表达与 HepG2的耐药性呈正相关 ，而 MDR、MRP的表达在耐药 的早期升 高不明显 ，随着耐药 程度的增加 其表达增 加。 结论 ： BCRP在 HepG2对 Oxal获得性耐药中起着 重要作用 ，MDR和 MRP在 HepG2／Oxal耐药过程 中早期起 的作用不 明显 ，随着耐药 浓度 的增加 ，表达越来越高。 [关键词]肝肿瘤 ；奥沙利铂 ；多药耐药蛋 白；乳腺癌耐药蛋 白 [中国图书资料分类法分类号]R735．7；R979．1 [文献标识码 ]A Roleofm ulti-drug resistance proteinsin drug resistance cellline HepG2／Oxalofhepatocellular carcinom a TENG Feng—meng‘， WUQiong，CHENChang-jie。，YANGQing—ling’，WANGHui (1．ResearchCenterofClinicalLaboratoryScience，BengbuMedicalCollege，BengbuAnhui233030； 2．DepartmentofMedicalOncology，TheF ￡AffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege，BengbuAnhui233004，China) [Abstract]Objective：Toinvestigatetheexpressionofmulti—drugresistance—associatedproteins(MDR)inHepatocellularcancercell lineHepG2andindifferentconcentrationsofsub—celllineofoxaliplatin(Oxa1)，andtostudythemechanismoftheirresistancetoOxa1． M ethods：HepG2multi—drugresistance sub—celllinewasinduced by increasing the concentration ofOxalprogressively，andthe drug resistancecellline2．5 g／mlHepG2／Oxaland5．0 mlHepG2／Oxalwassuccessfullyestablished．ThemRNA expressionofthe MDR，theexpressionofmulti—drugresistancerelatedprotein(MRP)andbreastcancerresistanceprotein(BCRP)inthecelllines (HepG2／Oxa1)of2．5 g／mlHepG2／Oxaland5．0 mlHepG2／OxalweredetectedusingRT—PCR，andthevariabilityofthegene expressionwasverifiedbyW estern blot．Results：HepG2／Oxaldrugresistance cellsubserieswith IC50valueof15 and25 timeswere successfullyconstructed．BCRP expression waspositively correlated with HepG2 dru gresistanceatmRNA and theprotein leve1．But MDR and MRP didnotdisplaysignificanthigh expression in the prophasedrugresistancesubseries；theexpressionofMDR andMRP increasedalongwiththeriseofdrugresistanceleve1．Conclusions：BCRP playsanimportantroleintheacquiredcharacterresistanceof HepG2 celllinetoOxal；theexpressionofMDR andMRP isnotobviousattheprophaseoftheresistance，butincreaseswiththeriseof theresistanceleve1． [Keywords]liverneoplasms；oxaliplatin；multi—drugresistanceprotein；breastcancerresistanceprotein 肝癌为我国最常见 的恶性程度极高、预后极差 的恶性肿瘤之一 ，发病率 高，治疗难度大，手术切除 (包括肝移植 )是 治愈的唯一方法 ；对于不能 切除 [收稿 日期]2010-02-03 [作者单位]1．蚌 埠医学 院 』临床检 验诊 断学实 验 中心 ，安徽 蚌 埠 233030，2．蚌埠 医学院第一附属医院 肿瘤 内科 ，安徽 蚌 坦 233004 [作者简介 ]滕风猛 (1981一)，男 ，硕士研究生． [通讯作者]陈昌杰 ，博士 ，硕士研究生导师 ，教授 ，E．mail：bbmcccj@ SOhl】．COIll 者 ，采取消融和介入治疗等手段 ，虽然提高了局部控 制率 ，却在延长患者 的生存 时间上不能令人满意。 晚期肝癌的系统性化疗仍有重要 的临床价值 ，但部 分 患者 往 往 由于 肝 癌 细 胞 的 多 药 耐 药 (multi—drug resistance，MDR)而导 致化疗无 效或逐渐 由有效 转 为无效。MDR的产生与多药耐药基 因、多药耐药蛋 白表达增多密切相关 。肝癌的 MDR是严重影 响 化疗效果及患者生存的主要原因。故研究肝癌对新 一 代化疗药物 的 MDR产生机制 ，对提 高肝癌 的化 疗效果 ，延长患者的生存期及 合理化疗方案 的应用 有着重要的意义。因此 ，探讨奥沙利铂 (oxaliplatin
2 J Bengbu Med Coll,January 2011,Vol.36,No.1 Oxl)在肝癌MDR中的作用机制，为临床合理使用 TGA AGG ACT TCG TGT CAG CC-3',antisense:5' 化疗方案及逆转剂提供理论基础。 GTC CAT GAT GGT CTT GAG CC-3'(扩增片段为 256 bp):BCRP sense:5'-CAG GTG GAG GCA AAT 1材料与方法 CTT CGT-3'antisense.5'-ACA CAC CAC GGA TAA 1.1仅器和试剂(1)细胞林：H©pG2细胞购于中 ACT GA-3(扩增片段为315p):GAPDH ense:5' 科院细胞研究所，不同浓度的HepG2/Oxal耐药细 CCC AAG GTG AAG GTC CG AGT C-3',antisense: 胞株由本实验室建立。于10%胎牛血清的DEM 5'-ACC ACA CCC CGC AGA GAT GAT-3'(扩增片 培养基中37℃，5%体积分数C02条件下培养。 段为375bp)。PCR反应体系为50 pl:cDNA10l, (2)主要试剂奥沙利铂干美国Sma公司，相对 引物浓度为50nm0/L.Ta酶1u。反应条件.94 分子质量为39729：DMEM培养基和胰酶均购自 1,94℃变性458,63℃退火30s,72℃延件 Gib公司：TT由上海华舜生物有限工程公司生 1min,共35个循环，最后72℃延伸10min。PCR 产。RNA反转录试剂盒购于Ferment公司。兔抗人 反应结束后，取5u!物于2.0%琼脂糖凝胶中电 乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, 泳，用Bio-Rad凝胶成像系统扫描并测定灰度值，判 BCRP)多药耐药相关蛋白（muli-drue resistanc 断耐药相关基因在亲本及不同耐药亚系中的表达水 related protein,MRP)、3-磷酸甘油醛脱氢砖 (glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH 1.2.4 m blot检测亲本及不同耐药亚系中耐 -抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔和大鼠抗小鼠多 药相关基因蛋白的表达分别收集对数生长期的亲 克隆抗体均购自北京中杉生物技术有限公司。ECL 本细胞2.5、5.0g/m耐药亚系的细胞，用细胞裂 发光试剂盒购自Amersham公司，Vestern blot法使 解液提取各细胞总蛋白，Bamd-fod法则定总蛋白 用的PVDF膜购于Millipore公司；预染标准分子量 g总蛋白进行I2%SDS-PAGE凝胶电 蛋白购自CIBCO/.BRL公司。 泳，电泳后转到PVDF膜。室温封闭】 h,分别加 1.2方法 抗人的(BCRP、MDR,MRP)一抗，抗体工作浓度为 1.2.1时药细腹株的球立采用浓度梯度透导法 1:200.GAPDH作为内参，于4℃解奋寸夜。TBS 律立2.5,5.0/ml浓度的奥沙利铂时药细胞株 Tween20缓冲液洗膜10min×3次.加入1：4000稀 HepG2/Oxal诱导按文献[2]将Oxal浓度递增诱导 释辣根过氧化物酶标记的偶联二抗室温温育1h: 至5g/m的DMEM培养基中维持生长：成功获得 BS ween20缓冲液洗膜10min×3次。加人ECl 2.5,5.0gml浓度下稳定耐药的细胞株，并在该 液在Bio-RAD成像分析系统上成像并进行密度分 浓度药物压力下稳定牛长 析，表示3种耐药蛋白的相对表达水平。 1.2.2耐药性的测定HpG2细胞在含10%的胎 1.3统计学方法采用方差分析和口检验 牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO, 和湿度的培养箱内培养 取对数生长期细胞，不同 2 结果 浓度的Oxal分别加人HepG2和HepG2/Oxl中作 2.】HepG2/Oxal性状测定耐药细胞和亲本细胞 用48后TT法测A值，重复3次取其平均值.计 的形态差异较大，且生长速度变慢。MTT法测定发 算细胞生存率=(A实验组一A空白组)/(A对照 现5.0ug/ml HepG2/0xal细胞对Oxal的1C50是 组-A空白组)×100%。根据细胞生存率绘制细胞 2.5:2.5 g/ml HepG2/0xal细胞对Oxdl的IC50 +算1C50 为7.71： epG2细胞对0xa 的 是0.49 RT-PCR检测亲本及不同浓度耐药亚系中 5.0 g/ml HepG2/Oxal耐药亚系细胞IC50是亲本 BCRP,MDR和MRP mRNA表达水平取对数生长 的25倍；2.5g/ml HepG2/0xal耐药亚系的1C50 期的亲本及2.5、5.0山/ml耐药亚系细胞，细胞 是亲本的15倍（见表1）。 RNA提取参照Tiol试剂说明书进行：cDNA合成 2.2亲本及不同耐药亚系中耐药相关基因mRN 参照Fem t公司的反转录试剂盒合成。利用引书 的表达 结果显示，在亲本H©pG2细胞与不同浓 设计软件Primer5.0设计，由上海生工生物有限公 耐药亚系HepG2/Oxal细胞中，随着耐药浓度的增 司合成。MDR sense:5'-CCC ATC ATT GCA ATA 加，BCRP mRNA的表达水平逐渐增加，各组间比较 CCA GG-3',antisense:5'-GTT CAA ACT TCT GCT 差异有统计学音义(P<O.01)。MDR MRP mRNA CCT GA-3'(扩增片段为156bp):MRP sense:5' 的表达水平也逐渐增加，但亲本和2.5g/ml耐药
12 Oxa1)在肝癌 MDR中的作用机制 ，为临床合理使用 化疗方案及逆转剂提供理论基础。 1 材料 与方法 1．1 仪 器和试 剂 (1)细胞 株 ：HepG2细 胞 购于 中 科院细胞研究所 ，不同浓度 的 HepG2／Oxal耐药细 胞株由本实验室建立。于 10％胎牛血清 的 DMEM 培 养 基 中 37 oC、5％ 体 积 分 数 CO，条 件 下 培 养 。 (2)主要试 剂 ：奥沙 利 铂 购 于美 国 Sigma公 司 ，相 对 分子 质 量 为 39729；DMEM 培 养 基 和 胰 酶 均 购 自 Gibco公 司 ；MTT由上 海 华 舜 生 物 有 限 【程 公 司生 产。RNA反转录试剂盒购于 Ferment公司。兔抗人 乳腺 癌 耐 药 蛋 白 (breastcancerresistanceprotein， BCRP)、多 药 耐 药 相 关 蛋 白 (multi—drugresistance related protein，MRP)、3一磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 (glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase，GAPDH) 一 抗 、辣根过氧化物酶标记羊抗兔和大 鼠抗小 鼠多 克隆抗体均购 自北京中杉生物技术有限公司。ECL 发光试剂盒购 自 Amersham公 司，Westernblot法使 用 的 PVDF膜购 于 Millipore公 司 ；预 染 标准 分 子 量 蛋 白购 自 GIBCO／BRL公 司 。 1．2 方 法 1．2．1 耐药细胞株的建立 采用浓度梯度诱导法 建立 2．5、5．0txg／ml浓 度 的 奥 沙利 铂 耐 药 细胞 株 ； HepG2／Oxal诱导按文献 [2]将 Oxal浓度递增诱导 至 5 ml的 DMEM培养基中维持生长；成功获得 2．5、5．0 g／ml浓 度 下稳 定 耐 药 的 细胞 株 ，并 在 该 浓度药 物压力 下稳定 生长 。 1．2．2 耐药性的测定 HepG2细胞在含 10％的胎 牛血清的 DMEM培养基 中，置于 37oC、5％CO，、饱 和湿度的培养箱内培养。取对数生 长期细胞 ，不 同 浓度的 Oxa1分别加入 HepG2和 HepG2／Oxal中作 用 48h后 MTI'法测 A值 ，重复 3次取其平均值 ，计 算细胞生存率 =(A实验组 一A空 白组 )／(A对照 组 一A空 白组 )×】00％ 。根据 细胞生 存率绘 制细 胞 存活曲线 ，计算 IC50。 1．2．3 RT—PCR检测亲本及不 同浓度 耐药亚 系中 BCRP、MDR和 MRPmRNA表达水平 取对数生长 期的亲本 及 2．5、5．0Ixg／ml耐药亚 系细胞 ，细胞 RNA提取参照 Trizol试剂 说明书进行 ；cDNA合成 参照 Ferment公 司的反转录试剂盒合成。利用引物 设计软件 Primer5．0设计 ，由上海生工生物有 限公 司合 成 。MDR sense：5．CCC ATC ATI'GCA ATA GCA GG一3 ，antisense：5 一GTIP CAA ACT TCT GCT CCTGA一3 (扩 增 片段 为 156bp)；MRPsense：5一 JBengbuMedColl，January2011，Vo1．36，No．1 ’I、GA AGG AC’r I、CG TGT CAG CC一3’，antisense：5 一 GTCCAT GAT GGT GTI"GAG CC-3 (扩 增 片 段 为 256bp)；BCRP sense：5-CAG GTG GAG GCA AAT CTF CGT一3 ．antisense：5 一ACA CAC CAC GGA TAA ACTGA一3(扩增 片 段为 315bp)；GAPDH sense：5． GGG AAG GTG AAG GTC GG AGT C 一3 ，antisense： 5一AGCAGA GGG GGCAGA GAT GAT一3 (扩增 片 段为 375bp)。PCR反应体系为 50Ixl：cDNA10Ixl， 引物浓 度为 50nmol／L，Taq酶 1U。反应条 件 ：94℃ 5rain，94qC 变性 45S，63oC退 火 30S，72cc 延 伸 1min，共 35个循环 ，最后 72℃延伸 10rain。PCR 反应结束后，取 5 l产物于 2．0％琼脂糖凝胶 中电 泳 ，用 Bio—Rad凝胶成像系统扫描并测定灰度值 ，判 断耐药相关基因在亲本及不同耐药亚系中的表达水 平 。 1．2．4 Westernblot检测亲本及不同耐药亚系中耐 药相关基因蛋白的表达 分别收集对数生长期的亲 本 细胞 、2．5、5．0 g／ml耐 药亚 系 的细胞 ，用 细胞 裂 解 液提取各细胞总蛋 白，Brand—ford法测定总蛋 白 浓度 。取 40 g总蛋 白进 行 12％ SDS—PAGE凝胶 电 泳 ，电泳后转到 PVDF膜。室温封闭 1h，分别加兔 抗人的(BCRP、MDR、MRP)一抗 ，抗体工作 浓度为 1：200，GAPDH作为 内参 ，于 4℃孵 育 过夜。TBS． Tween20缓冲液洗膜 10min×3次 ，加入 1：4000稀 释辣根过氧化物酶标 记的偶联 二抗室 温温育 1h； TBS．Tween20缓 冲液 洗膜 10minX3次 。加人 ECL 液 在 Bio—RAD 成 像 分 析 系 统 上 成 像 并进 行 密度 分 析 ，表示 3种耐药蛋 白的相对表达水平。 1．3 统计 学方法 采用方差分析和 q检验。 2 结果 2．1 HepG2／Oxal性状测定 耐药细胞和亲本细胞 的形 态差 异较 大 ，且 生 长速 度 变慢 。MTI'法 测定 发 现 5．0 g／mlHepG2／Oxal细胞 对 Oxal的 IC50是 l2．5；2．5 mlHepG2／Oxal细 胞 对 Oxal的 IC50 为 7．71；HepG2 细 胞 对 Oxal的 IC50 是 0．49。 5．0 g／mlHepG2／Oxal耐药亚系细胞 IC50是亲本 的 25倍 ；2．5 mlHepG2／Oxal耐药亚 系的 IC50 是亲本的 l5倍(见表 1)。 2．2 亲本及 不 同耐 药亚 系 中耐 药相 关基 因 mRNA 的表达 结果显示 ，在亲本 HepG2细胞与不 同浓度 耐药亚系 HepG2／0xal细胞 中，随着 耐药浓度的增 加 ，BCRPmRNA的表达水平逐渐增加 ，各组间比较 差异有统计学意义(P<0．01)。MDR、MRPmRNA 的 表达水平也逐 渐增加 ，但亲本和2．5Ixg／ml耐药
埠医学院学报2011年1月第36卷第1 13 表】不同浓度作用下亲本与耐药细胞存活率(m,-5;±】 亚系之间差异无统计学意义(P>0.05),亲本与5.0 浓 g/m) 亲本细胞 2.5μg/ml 5.0g/m g/ml及2.5gml和5.0ugm耐药亚系之间比 耐打亚考 谢药亚系 较差异有绕计学意义(P0.05),但亲本与2.5g/ml和5.0gml耐药 408.80 416.40 104.15 亚系之间相比较差异有统计学意义(P<0.05)(见 <0.0 图2、表3)。 0.00 0.00 120 3 000b 2000p 000 0 500bp MR 250bp 0250511522557.510 50 bp 00b 100bp 2/0 1:0g/ 12:2.5/HenG2/0a,3:HerC2毫本：rk 图23种耐药幕因在亲本及不同耐药亚系中RNA的表达 1 3 表2亲本及不同耐药亚系中与GAPDH mRNA表达的相 BCEP 对密度比值(%)比较(，=5：x±) 分组 MDR MRP RCRP MRP 0.420.10 048,00 2.5g/m耐药五系27.31±0.5% 0.61±0.4 0.51±0.10 MDR 5.0/ml耐药亚系 0.8±0.21 GAPDH x0.0 <0.04 0.292 0.025 0.100 g检验：与HcpC2亲本胞组比较*P<0.05 图33种耐药蛋白在亲本及不问时药亚系细胞中蛋白的表达 表3 亲本及不同浓度耐药亚系中蛋白表达与GAPDH的 相对密度比值(%)比较(n,=5; 3讨论 MDR蛋自 肝癌在我国发病率高，治疗难度大，预后凶险 分组 BCRP 晚期肝癌的系统性化疗仍有重要的临床价值，顺铂 0520 阿霉素等既往用于肝癌化疗的药物有效率低，不能 5.0g/ml制药系 32.78 显著延长患者的生存期，新一代化疗药物如0xl、吉 c0.01 西他淀和卡培他滨等的疗效有了显著提高。虽然分 <0. <D. 0.42 0.030 G022 子把向药物代表了晚期肝癌药物治疗的方向，但从 g检跪：与CG2亲本细圆比较*P<0.05
蚌埠医学院学报 2011年 1月第 36卷第 1期 表 1 不 同浓度作用下亲本 与耐药细胞存活率 (n =5；±S) 120 i00 ＼ 豫 佰 80 仕 60 = 4O 2O O 0 0．25 0．5 1 1．5 2 2．5 5 7．5 i0 不 同浓 度 ／mg·L。。 + HepG2 亲 本 细 胞 + 2．5 ug／m1 HePG2／oxa1 5．0 gg／m1HepG2／0xa1 图 1 细 胞 存 活 曲线 13 亚系之问差异无统计学意义(P>0．05)，亲本与 5．0 g／ml及 2．5 g／ml和 5．0 ml耐药亚系之 间比 较差异有统计学意义(P0．05)，但亲本与2．5 ml和 5．0 ml耐药 亚 系之 间相 比较 差 异有 统计 学 意义 (P<0．05)(见 图 2、表 3)。 2000bp 1000 bp 750bp 500bp GAPDH MRP 250 bp 2 000 bp i000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 1O0 bp 1：5．0~g／mlHepG2／0xal：2：2．5 P-g／m1HepG2／Oxal：3：HepG2亲 本细 胞 ；M：Marker 图 2 3种 耐 药 基 因 在 亲 本 及 不 同耐 药 亚 系 ~mRNA的 表 达 1 2 3 表 2 亲本及不 同耐药亚 系中与 GAPDHmRNA表达 的相 BCRP 一 … 对密度 比值 (％ )比较 (n=5； ±S) q检验：与 HepG2亲本细胞组比较★P<O05 表 3 亲本及不 同浓度耐药亚系中蛋 白表达与 GAPDH的 相对密度比值 (％ )比较 (n =5；孑±S) q检验：与 HepG2亲本细胞比较-kP<O．05 1：亲 本 HepG2细 胞 ；2：2．5 g／m1HepG2／0xa1耐 药 亚 系 3：5．0 g／mlHepG2／Oxal耐 药 亚 系 3 3种 耐药 蛋 白在 亲本 及不 同耐 药 亚系细 胞 中蛋 白的表达 3 讨论 肝癌在我国发病率高 ，治疗难度大 ，预后凶险。 晚期肝癌的系统性化疗仍有重要的临床价值 ，顺铂 、 阿霉素等既往用于肝癌化疗 的药物有效率低 ，不能 显著延长患者的生存期 ，新一代化疗药物如 Oxal、吉 西他滨和卡培他滨等的疗效有了显著提高。虽然分 子靶向药物代表了晚期肝癌药物治疗 的方 向，但从
14 J Bengbu Med Coll,January 2011,Vol.36,No.I 我国的医宁现软和酸本效拾角府分析，化宁仍然是 鹏"等报道的HepG2/ADM中起主要作用的是 晚期肝系统治疗的基础。最近，多个Ⅱ期临床研 MDRI和BCRP,但MRPI与肝癌的耐药无关。本 究+表明含有新一代化疗药物的方案如GEMOX、 究显示HenG2/Oxal的附药与这3个基因相关，只是 XE1OX等，在控制晚期肝癌进展、改善生活质量力 在不同时间段起的作用不同，肝癌的MDR与国外 面疗效确切，并初步观察到生存期长益，且这些方案 报道的如在白血病和结直肠癌中得到的结果不同 与分子靶向药物联合使用有增效作用。可见，新 这可能与不同组织来源的肿瘤细胞多药耐药机制的 一代化疗药物的联合方案，或与分子靶向药物联合 相对独立性有关。本文揭示了在肝癌耐药的过程可 成用，在晚期肝晾系统性治疗方面取得了长足进步， 能是一个多因索参与的过程，在不同的阶段耐药蛋 然而，肝癌耐药是系统性化疗失败的根源 白所起的不同作用，为我们对肝癌耐药逆转提供了 缩耐药有内在性和获得性2种类型，前者是肿瘤细 新的靶点，也为临床上合理的安排化疗方案，防止时 胞原发性耐药，后者是肿瘤细胞在反复接触药物的 瘤耐药的形成和新的靶向分子药物的应用提供了良 过程中获得的时药，也为临床上主要的药形式 好的理论基础 肿瘤细胞耐药机制包括：药物聚集降低，细胞内药物 【参考文献】 分布改变、细胞周期失控、调亡反应降低、基因损伤 [」胡俊峰夏与梅，李发明，等.LRP和MRP在肺悠中表达及其 临k登义「J,非埠灰学院学业，2010.25(1)：17-19. 修复增加以及药物靶标突变等 甘前已知肝扇 [2】YanT,hgE.Eatd ent of multidnaz 耐药主要与药物转运系统或者代谢酶的异常表达有 cell line MCF-7/MDRa and its prelim 关，而周亡抑制蛋白IAPg和转录因子NF-KB等的 wei=[J1.Chin J Cll Biol.2006,29(4):591-595. 异常激活，也在很大程度上决定了肝癌对药物的反 3 Samay I..Valerie B.Michel D.et al.Gemcitabine plus oxaliplati 应。例如：转运体P糖蛋白(P-即，MDR1)的过表达 n patie 2007.109(7):1384-1390 参与了肝癌的MDR,其他药物转运体MRP、肺抗 [4]Boige V.Raoul J..Pignon JP.er af.Multicentre phase ll trial o 拒相关蛋白等参与了不同药物在肝癌中的化疗抗 cupecitabine plus oxaliplatin in patients with advance 拒“。可见，肝癌具有复杂和多面的耐药机制。 reinoma:FFCD 03 -03 trial[J].Br J Caneer. 本研究通过奥沙利铂浓度递增诱导法建立不而 2007.97(7):862-867. 浓度的HepG2/Oxal耐药亚系模型，其耐药程度较 [5]Asnacios A.Fartous L.Romano 0.e al.Gemcitabine plu oxaliplatin combined with cetuximab in patients with progressiv 亲本细胞大大提高，且能够获得稳定的耐药表型：这 advaneed stage hepatocellular carcinomu: ts of a multicente 与文献报道相类似。进一步研究显示，肝 hae2ub」月.Car.2008.112(12):2733-2739. MDR细跑HeDG2/Oxal中BCRP随着时药浓度的增 加而增加：MDR和MRP表达随着耐药浓度的增加 Rev Med.2002.53:615-617. 7] Ng IO,Liu CL.Fan ST,et af.Expression of P-glycoprotein ir 而增加，们在开始低浓度时药时所增加的不是很明 显，随着耐药浓度的增大，MDR和MRP增加的越明 respons!Am Clin Pathol,2000.11(3):355-363. 显。并且在蛋白水平也发现了这3个基因在耐药细 [8] Nies AT.Konig J.Pfanrachmidt M,e al.Expreseion of the multidru 胞中高表达，并与TPCR相-一致。揭示了这3个 esistance proteins MRP2 and MRP3 in human bepatocellula 基因的高表达是肝癌MDR机制的重要分子基础 .n」C,2001,94(4）:492499. [91 马晓峰，张莲芬，屈琳，等，化疗药体外于顶诱导人乳腺惑细 在肝高MDR中BCRP托主要作用.议与克用等 跑产生附约性的研究1J}.中国药理学通报，2009,25(11) 报道的通过抑制CK8和BCRP的表达可以有效逆 733-777 转乳腺隔对奥秒利铂MDR相一致。MDR和RF 10]袁用，程听，许元富，等.降低细胞膜角蛋白8和孔恐格房秘 在低剂量耐药中起的作用很小；但随着耐药浓度的 蛋1的表达逆转耐药榨1J】,中国药理学通报.2009,25(11》 增大所起的作用越来越明显。 1425-1429 「11门李高调，陈羊平.其，等.老药附钙蛋1在肝岛耐药组胞新 通过比较我们发现在肝癌的耐药过程巾，不同 的耐药基因所起的作用不同，肝痛细胞对不同药物 Hp2/ADM中的作用J.中华普返外科杂志，2006.2 (11):766-768 耐药的过程中有不同的耐药基因参与。例如李高 (本文编辑刘璐)》
14 我 国的医疗现 状 和成 本效 益 角 度分 析 ，化 疗 仍 然是 晚期肝 犏 系统 治疗 的基 础 。最 近 ，多 个 Ⅱ期 临 床研 究 ～ 表明含有新一代化疗药物的方案如 GEMOX、 XELOX等 ，在控制晚期肝癌进展、改善牛活质量方 面疗效 确切 ，并 初步 观察 到牛存期 获益 ，且这些 方案 与分子靶向药物联合使用有增效作用 。可见 ，新 一 代化疗药物的联合方案 ，或与分子靶向药物联合 应用 ，在 晚期肝 癌 系统 性治疗 方 面取得 了 长足进 步 。 然 而 ，肝癌 耐 药是 系 统 性化 疗 失 败 的根 源 ：肿 瘤 耐约有 内在性 和 获得 性 2种类 型 ，前 者 是肿 瘤 细 胞 原发性 耐药 ，后者 是 肿 瘤 细胞 存反 复接 触药 物 的 过 程 中狱 得 的 而寸药 ，也 为 临 床 J主要 的 耐药 形 式 。 肿瘤细胞耐约机制包括 ：药物聚集降低 、细胞内药物 分布改变 、细胞周期失控 、凋亡反应降低 、基 因损伤 修复增加 以及药物靶标 突变等 。目前 已知肝癌 耐药 主要 与药物转 运系 统或者 代谢酶 的异 常表达 有 火 ，而凋 亡抑 制 蛋 白 IAPs和 转 录 因子 NF—KB等 的 异常 激活 ，也 在很 大程 度 j一决定 r肝 癌 对药 物 的 反 应。例女I1：转运体 P糖蛋 白(P—gP，MDR1)的过表达 参与_r肝癌的 MDR j，其他药物转运体 MRP、肺抗 拒相 关 蛋 白等 参 与 了 不 同 药 物在 肝癌 中 的化 疗 抗 拒 见，肝癌具有复杂和多面的耐药机制。 本研 究通 过奥沙 利铂 浓度递 增诱导 法建 市小 同 浓度 的 HepG2／Oxal耐 药 亚 系 模 型 ，其 耐 药 程 度 较 亲本细胞 大大 提高 ，且 能够 获得稳 定 的耐药表 型 ；这 与文献 报 道相 类 似 进一 步 研 究 显示 ，肝痛 MDR细胞 HepG2／Oxal巾 BCRP随着 耐药浓 度 的增 加 而增加 ；MDR和 MRP表达 随着 耐 药 浓度 的增 加 而增加 ，但在开始低浓度耐药时所增加的不是很明 ， 随着耐 药浓度 的增 大 ，MDR和 MRP增 加 的越 明 显 。并且 蛋 白水 平也 发现 lr这 3个 基 因在 耐药 细 胞 中高表 达 ，并 与 RT—PCR相 一 致 。揭 示 了这 3个 因的高 表达 足肝 癌 MDR机 制 的重 要 分 子 基 础 ， 在肝癌 MDR 中 BCRP起主要作用 ，这与袁翔等_】” 报道的通过抑制 CK8和 BCRP的表达 呵以有效逆 转 乳 腺 痛 对 奥沙 利铀 MDR相 一 致 。MDR 和 MRP 存低剂髓耐药巾起的作用很小 ；但随着耐约浓度 的 增大所起的作片j越来越 明显。 通过 比较我 们发 现 在 肝癌 的 耐药 过 程 巾 ，不 列 的耐 药基 所起 的作 用 不 同 ，肝癌 细 胞 对不 同药 物 耐药的过程 巾仃不 同的耐药翠 因参 与。例如李高 JBengbuMedCoil，January2011，Vo1．36，No．1 …鹏 lH 显究 存 道报 可这 对相 是能 所白 的新 耐瘤 的好 ．．． ¨