刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 道菌群在溃疡性结肠炎的发病中起了一定的见的感染性细菌. ■应用要点 作用.Wang等采用 T-RFLP技术分析哺乳期陈燕飞运用美国俄克拉荷马大学环境是目前的研究热 前后婴儿肠道菌群的变化,并指出 T-RFLP技基因研究中心研发的第5代功能基因芯片,对点,该综主要介 术在研究粪便微生物群变化方面有很大的优酒精性肝硬化、乙型肝炎肝硬化和正常对照为临床科研工作 势此外,国内也有学者建立了人粪便菌群柔三组研究人群的粪便微生物功能结构进行分提供参考价 嫩梭菌类群特异性的 T-RFLP方法,并认为,虽析,发现肝硬化患者肠道微生物功能基因结构 然 T-RFLP与DGGE灵敏度相同,但TRFP技术与正常对照显著不同、涉及营养物质代谢的 重复性更好,定量更准确,实验流程也比DGGE功能基因显著减少 的操作步骤简单很多,适用于大规模样品的比 临床上,基因芯片技术多用于对致病菌的 对,且不同批次的样品之间误差较小,减少人检测.毛正果等围建立的针对16SRNA序列 为误差,并能最低检测到群落中比例为1%的细基因芯片检测系统,能够成功地鉴定临床常见 菌,具有高重复性、高通量、易于数字化等特的14种肠道致病菌.王军等例也对7种腹泻病 点但是 T-RFLP的成本要比DGGE高 致病菌进行检测,检测阳性符合率为100%,敏 感性高于粪便培养方法 3分子探针技术及基因芯片技术 虽然基因芯片技术已经广泛应用于微生 3.1荧光原位杂交荧光原位杂交( luorescent in物研究领域,但也存在一定的缺陷.基因芯片 situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交的提取纯化过程需要手动操作,不可避免会引 基础上,以荧光标记取代同位素标记而形成的 起人为误差,所以,选择误差较小的提取方法 种杂交方法将带有荧光标记的寡核苷酸探是整个检测的基础而且,由于探针的杂交 针直接与经过处理的细胞杂交,使探针渗透到 有一定的错配率,如何区分由此所造成的假阳 细胞内的核酸,用荧光显微镜即可观察到带有性是临床微生物芯片面临的主要挑战另外 杂交荧光标记探针的细胞,通过计算杂交率来基因芯片的技术成本昂贵、复杂、无法鉴定 定量检测和鉴定细菌他不需要通过纯化或扩亚群以及灵敏度等问题也限制了基因芯片的 增步骤,即可在自然或人工的微生物环境中监 发展 测和鉴定不同的微生物个体,同时对群落组成 进行分析在临床工作中,荧光原位杂交技术4宏基因组 (metagenome测序 一般用于对已知菌群的检测,却不能检测未知宏基因组是指环境中全部微小生物(目前主要 菌群.钟燕等选用5种特异性的16 SIRNA寡包括细菌和真菌)DNA的总和,宏基因组学是 核苷酸探针,应用荧光原位杂交技术分析乳糖由Pace和 handelsman于上世纪90年代提出的 不耐受者双歧杆菌的构成.但是,由于部分微门应用学科,直接提取环境样品中的宏基因组 生物也会发出免疫荧光,所以会产生一定的假进行高通量测序和生物信息学分析,寻找和发 阳性和假阴性,而且,若细菌中RNA含量较低,现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法 则检出率也会下降这些都会造成实验误差. Relman实验室和美国基因组研究所于2005年 32基因芯片技术基因芯片又称为DNA微阵第一次全面开展人类肠道宏基因组学的研究 列,是在分子杂交技术基础上发展起来的一种完善我们对肠道微生物多样性的认识国外 新型分子生物技术.基本原理是将大量探针固 Manichanh等向首次采用宏基因组学方法发现 定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,克隆恩病( Crohn's disease,CD)患者粪便样品 通过荧光扫描及计算机分析样品中的基因序中厚壁菌门的多样性较健康人群明显减少,发 列及表达信息,有高通量、高信息量、快速、现了一种新物种的存在2010年,欧盟资助的 样品用量少、造价低、用途广泛等优点可以“人类肠道元基因组计划( MetahIT)”进行了 同时对上千个基因进行快速分析,因此对像肠迄今最大的肠道细菌基因研究,为后续研 道菌群这样成分复杂的样品,基因芯片展现出道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提 很大的优势极大提高了检测效率3翟俊辉供重要的理论依.国内学者利用宏基因组学 等成功制备了大肠埃希菌、伤寒沙门菌等的方法,对乙型肝炎肝硬化患者肠道微生物群 20多种细菌的基因芯片,成功的检测到临床常落结构及功能代谢进行了全面分析,发现乙型 3145 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3145 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■应用要点 肠道菌群的研究 是目前的研究热 点, 该综述主要介 绍各种检测方法, 为临床科研工作 提供参考价值. 道菌群在溃疡性结肠炎的发病中起了一定的 作用. Wang等[31] 采用T-RFLP技术分析哺乳期 前后婴儿肠道菌群的变化, 并指出T-RFLP技 术在研究粪便微生物群变化方面有很大的优 势. 此外, 国内也有学者建立了人粪便菌群柔 嫩梭菌类群特异性的T-RFLP方法, 并认为, 虽 然T-RFLP与DGGE灵敏度相同, 但T-RFLP技术 重复性更好, 定量更准确, 实验流程也比DGGE 的操作步骤简单很多, 适用于大规模样品的比 对, 且不同批次的样品之间误差较小, 减少人 为误差, 并能最低检测到群落中比例为1%的细 菌, 具有高重复性、高通量、易于数字化等特 点[32] . 但是T-RFLP的成本要比DGGE高. 3 分子探针技术及基因芯片技术 3.1 荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交 基础上, 以荧光标记取代同位素标记而形成的 一种杂交方法. 将带有荧光标记的寡核苷酸探 针直接与经过处理的细胞杂交, 使探针渗透到 细胞内的核酸, 用荧光显微镜即可观察到带有 杂交荧光标记探针的细胞, 通过计算杂交率来 定量检测和鉴定细菌. 他不需要通过纯化或扩 增步骤, 即可在自然或人工的微生物环境中监 测和鉴定不同的微生物个体, 同时对群落组成 进行分析. 在临床工作中, 荧光原位杂交技术 一般用于对已知菌群的检测, 却不能检测未知 菌群. 钟燕等[33] 选用5种特异性的16S rRNA寡 核苷酸探针, 应用荧光原位杂交技术分析乳糖 不耐受者双歧杆菌的构成. 但是, 由于部分微 生物也会发出免疫荧光, 所以会产生一定的假 阳性和假阴性, 而且, 若细菌中rRNA含量较低, 则检出率也会下降, 这些都会造成实验误差. 3.2 基因芯片技术 基因芯片又称为DNA微阵 列, 是在分子杂交技术基础上发展起来的一种 新型分子生物技术. 基本原理是将大量探针固 定于支持物上, 然后与标记的样品进行杂交, 通过荧光扫描及计算机分析样品中的基因序 列及表达信息, 有高通量、高信息量、快速、 样品用量少、造价低、用途广泛等优点. 可以 同时对上千个基因进行快速分析, 因此对像肠 道菌群这样成分复杂的样品, 基因芯片展现出 很大的优势极大提高了检测效率[34,35] . 翟俊辉 等[36] 成功制备了大肠埃希菌、伤寒沙门菌等 20多种细菌的基因芯片, 成功的检测到临床常 见的感染性细菌. 陈燕飞[37] 运用美国俄克拉荷马大学环境 基因研究中心研发的第5代功能基因芯片, 对 酒精性肝硬化、乙型肝炎肝硬化和正常对照 三组研究人群的粪便微生物功能结构进行分 析, 发现肝硬化患者肠道微生物功能基因结构 与正常对照显著不同、涉及营养物质代谢的 功能基因显著减少. 临床上, 基因芯片技术多用于对致病菌的 检测. 毛正果等[38] 建立的针对16SrRNA序列的 基因芯片检测系统, 能够成功地鉴定临床常见 的14种肠道致病菌. 王军等[39] 也对7种腹泻病 致病菌进行检测, 检测阳性符合率为100%, 敏 感性高于粪便培养方法[40,41] . 虽然基因芯片技术已经广泛应用于微生 物研究领域, 但也存在一定的缺陷. 基因芯片 的提取纯化过程需要手动操作, 不可避免会引 起人为误差, 所以, 选择误差较小的提取方法 是整个检测的基础[42] . 而且, 由于探针的杂交 有一定的错配率, 如何区分由此所造成的假阳 性是临床微生物芯片面临的主要挑战. 另外, 基因芯片的技术成本昂贵、复杂、无法鉴定 亚群以及灵敏度等问题也限制了基因芯片的 发展. 4 宏基因组(metagenome)测序 宏基因组是指环境中全部微小生物(目前主要 包括细菌和真菌)DNA的总和, 宏基因组学是 由Pace和andelsman于上世纪90年代提出的一 门应用学科, 直接提取环境样品中的宏基因组 进行高通量测序和生物信息学分析, 寻找和发 现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法. Relman实验室和美国基因组研究所于2005年 第一次全面开展人类肠道宏基因组学的研究, 完善我们对肠道微生物多样性的认识[43] . 国外 Manichanh等[44] 首次采用宏基因组学方法发现 克隆恩病(Crohn's disease, CD)患者粪便样品 中厚壁菌门的多样性较健康人群明显减少, 发 现了一种新物种的存在. 2010年, 欧盟资助的 “人类肠道元基因组计划(MetaHIT)”进行了 迄今最大的肠道细菌基因研究, 为后续研究肠 道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提 供重要的理论依[45] . 国内学者利用宏基因组学 的方法, 对乙型肝炎肝硬化患者肠道微生物群 落结构及功能代谢进行了全面分析, 发现乙型