刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 ■相吴报道 化,发现盲肠部位的大肠杆菌数量增多,而乳不同的DNA片段区分开来DGGE分辨率高,适 采用工RFLP分杆菌和双歧杆菌的数量大大减少.Kim等采用于检测100500bp的片段,不需同位素掺入 析痛性结肠炎用实时荧光定量PCR对30例功能性便秘患者避免了同位素污染由于肠道微生物种类很 UC)小鼠的肠道的研究发现,他们肠道菌群的双歧杆菌和拟杆只有占群落1%以上的种群才能被检测出来P2 菌群的多样性和菌的数量减少,通过益生菌的治疗,肠道菌群DGGE具有技术可靠、可重复、快速和容易操 肠遁菌群发生了可以恢复正常 作的特点,可直接显示微生物群落中优势组成 速“单在U23基于PCR基础上的16SDNA指纹技术 成分,可同时对多个样品进行分析湖 的发病中起了一23.1肠道细菌基因间重复序列-PCR:肠道细 周帅等采用 DGGE-PCR方法研究脓毒 定的作用 菌基因间重复序列( enterobacterial repetitive症大鼠肠道菌群的变化,发现回肠部大肠杆菌 Intergenic consensus,ERIC)是由 Sharple等于增多,乳酸菌和毛螺旋菌科细菌减少,而结肠 1990年在肠道细菌(霍乱弧菌Ⅴ cholerae除外)部大肠杆菌和口腔普雷沃菌增加,乳杆菌减少, 基因组中发现的长约124-127bp的非编码保证明了回肠和结肠的菌群发生显著改变,不同 守重复序列,ERIC-PCR扩增产物的大小为肠段的菌群变化规律也不同 50-3000bp,每种菌株均存在着数目不等的各 梯度凝胶电泳( temperature gradient 自独特的电泳带型,且主带型能够重复稳定出 gel electrophoresis,TGGE技术的基本原理与 现,可用来区别不同种的细菌和同一种细菌DGGE技术相似,凝胶温度梯度呈线性增加,可 中不同菌株. Di Giovanni等于1999年首次以有效分离PCR产物及目的片段TGGE技术 将这种ERIC-PCR技术应用到混合菌群群落与化学变性剂形成梯度的DGGE技术相比,梯 结构的分析研究上,得到能够反映菌群组成差度形成更加便捷,重现性更强wei等采 异的、重复性好而又稳定的指纹图谱.因此,用TGGE-PCR对三只大熊猫的肠道菌群进行 ERIC-PCR的指纹图谱能很好地记录混合菌群研究,认为熊猫的肠道细菌的种类与其他食草 的微生物生态结构信息.在医学研究中,该技动物有很大区别,而肠道菌群的失衡导致竹 术主要用来分析肠道菌群的多样性,通过不同子在肠道中不易被消化国内学者用TGGE技 样品间条带的分布、亮度和数量的变化,推测术分析人肠道中双歧杆菌的组成.之所以采用 出菌群的变化,也可回收DNA主带,进行克隆TGGE技术,是因为其可以显著节约样品DNA 测序,可知样品中的优势菌群,探讨菌群与疾通常用于TGGE分析的DNA仅需十到几十纳 病的关系.鲁海峰曾采用 ERIC-PCR的方法对克,而DGGE一般需180-300ng,对一些肠道内 熊猫肠道微生物结构进行研究,得到大熊猫不双歧杄菌含量较少的个体的样品,选择TGGE 同个体肠道微生物群落结构比较相似且稳定更为灵敏 的结论L等也采用ERIC-PCR技术研究2.33末端限制性片段长度多态性分析:末端限 IBD患者的肠道菌群,证明了健康人比BD患制性片段长度多态性分析( Terminal- restrictio 者的肠道菌群多样性更明显 agent length polymorphism, T-RFLP技术综 2.3.2变性梯度凝胶电泳/TGGE-PCR:变合了PCR技术、DNA限制性酶切技术、毛细 性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gel管电泳技术、荧光标记技术和DNA自动测序 electrophoresis, DGGE)技术是由 Fischer于1979仪等技术,通过对特定DNA片段多态性的测定 年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术,来分析比较微生物的群落结构. T-RFLP技术不 起初主要用于医学上, Muyzer等凹在1993年首仅可以进行微生物种类的定性分析,也可以进 次将这项技术应用到微生物群落结构研究方行定量分析.此外,RFLP还显示出各菌株间的 面,发现其在研究微生物种群方面具有很大的DNA差异,故可用作种以下菌株的鉴定.熊婧 优势.他既可以对比分析不同的微生物群落之采用T-RFLP技术分析微生物群落中双歧杆菌 间的差异,也可以研究同一微生物群落的变化的特异性 情况.DGGE的原理是使用具有化学变性剂梯 Hakansson等采用 T-RFLP分析DSS诱导 度的聚丙烯酰胺凝胶,双链DNA片段在聚丙烯的溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群的多样性和 酰胺凝胶电泳时的迁移行为主要取决于其分群落结构,发现肠道菌群的总量及乳杆菌、大 子的大小和带电荷的多少,使同样长度但序列肠杆菌等的数量均发生了改变,从而证明肠 . 5Aishideng 3144 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3144 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■相关报道 国外Håkansson 采用T-RFLP分 析溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC)小鼠的肠道 菌群的多样性和 群落结构, 发现 肠道菌群发生了 改变, 从而证明 肠道菌群在U C 的发病中起了一 定的作用. 化, 发现盲肠部位的大肠杆菌数量增多, 而乳 杆菌和双歧杆菌的数量大大减少. Kim等[16] 采 用实时荧光定量PCR对30例功能性便秘患者 的研究发现, 他们肠道菌群的双歧杆菌和拟杆 菌的数量减少, 通过益生菌的治疗, 肠道菌群 可以恢复正常. 2.3 基于PCR基础上的16S rDNA指纹技术 2.3.1 肠道细菌基因间重复序列-PCR: 肠道细 菌基因间重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)是由Sharple等于 1990年在肠道细菌(霍乱弧菌V cho1erae除外) 基因组中发现的长约124-127 bp的非编码保 守重复序列, ERIC-PCR扩增产物的大小为 50-3000 bp, 每种菌株均存在着数目不等的各 自独特的电泳带型, 且主带型能够重复稳定出 现, 可用来区别不同种的细菌和同一种细菌 中不同菌株[17] . Di Giovanni等[18] 于1999年首次 将这种ERIC-PCR技术应用到混合菌群群落 结构的分析研究上, 得到能够反映菌群组成差 异的、重复性好而又稳定的指纹图谱. 因此, ERIC-PCR的指纹图谱能很好地记录混合菌群 的微生物生态结构信息. 在医学研究中, 该技 术主要用来分析肠道菌群的多样性, 通过不同 样品间条带的分布、亮度和数量的变化, 推测 出菌群的变化, 也可回收DNA主带, 进行克隆 测序, 可知样品中的优势菌群, 探讨菌群与疾 病的关系. 鲁海峰曾采用ERIC-PCR的方法对 熊猫肠道微生物结构进行研究, 得到大熊猫不 同个体肠道微生物群落结构比较相似且稳定 的结论[19] . Li等[20] 也采用ERIC-PCR技术研究 IBD患者的肠道菌群, 证明了健康人比IBD患 者的肠道菌群多样性更明显. 2.3.2 变性梯度凝胶电泳/T G G E-PCR: 变 性梯度凝胶电泳(dena turing gr adi ent ge l electrophoresis, DGGE)技术是由Fischer于1979 年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术, 起初主要用于医学上, Muyzer等[21] 在1993年首 次将这项技术应用到微生物群落结构研究方 面, 发现其在研究微生物种群方面具有很大的 优势. 他既可以对比分析不同的微生物群落之 间的差异, 也可以研究同一微生物群落的变化 情况. DGGE的原理是使用具有化学变性剂梯 度的聚丙烯酰胺凝胶, 双链DNA片段在聚丙烯 酰胺凝胶电泳时的迁移行为主要取决于其分 子的大小和带电荷的多少, 使同样长度但序列 不同的DNA片段区分开来. DGGE分辨率高, 适 用于检测100-500 bp的片段, 不需同位素掺入, 避免了同位素污染. 由于肠道微生物种类很多, 只有占群落1%以上的种群才能被检测出来[21,22] . DGGE具有技术可靠、可重复、快速和容易操 作的特点, 可直接显示微生物群落中优势组成 成分, 可同时对多个样品进行分析[23,24] . 周帅等[25] 采用DGGE-PCR方法研究脓毒 症大鼠肠道菌群的变化, 发现回肠部大肠杆菌 增多, 乳酸菌和毛螺旋菌科细菌减少, 而结肠 部大肠杆菌和口腔普雷沃菌增加, 乳杆菌减少, 证明了回肠和结肠的菌群发生显著改变, 不同 肠段的菌群变化规律也不同. 温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)技术的基本原理与 DGGE技术相似, 凝胶温度梯度呈线性增加, 可 以有效分离PCR产物及目的片段. TGGE技术 与化学变性剂形成梯度的DGGE技术相比, 梯 度形成更加便捷, 重现性更强[26] . Wei等[27] 采 用TGGE-PCR对三只大熊猫的肠道菌群进行 研究, 认为熊猫的肠道细菌的种类与其他食草 动物有很大区别, 而肠道菌群的失衡导致竹 子在肠道中不易被消化. 国内学者用TGGE技 术分析人肠道中双歧杆菌的组成. 之所以采用 TGGE技术, 是因为其可以显著节约样品DNA. 通常用于TGGE分析的DNA仅需十到几十纳 克, 而DGGE一般需180-300 ng, 对一些肠道内 双歧杆菌含量较少的个体的样品, 选择TGGE 更为灵敏[28] . 2.3.3 末端限制性片段长度多态性分析: 末端限 制性片段长度多态性分析(Terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)技术综 合了PCR技术、DNA限制性酶切技术、毛细 管电泳技术、荧光标记技术和DNA自动测序 仪等技术, 通过对特定DNA片段多态性的测定 来分析比较微生物的群落结构. T-RFLP技术不 仅可以进行微生物种类的定性分析, 也可以进 行定量分析. 此外, RFLP还显示出各菌株间的 DNA差异, 故可用作种以下菌株的鉴定. 熊婧 采用T-RFLP技术分析微生物群落中双歧杆菌 的特异性[29] . Håkansson等[30] 采用T-RFLP分析DSS诱导 的溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群的多样性和 群落结构, 发现肠道菌群的总量及乳杆菌、大 肠杆菌等的数量均发生了改变, 从而证明肠