刘玉婷,等.肠道菌群的检测方法及研究进展 收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方很难模拟自然环境的条件,因而无法得到其纯■研发沿 面发挥着重要作用,与很多疾病的发生发展培养物而且细菌培养涉及多种培养基的选择后续研究肠道微 相关.研究肠道菌群对临床治疗具有非常重和对微生物的检测,这在很大程度上取决于技生物与人的肥 要的意义本综述着重论述聚合酶链式反应术人员的经验和技巧η.此外,培养法只能培养的关系提供重要 技术( polymerase chain reaction,PCR)、基于活的细菌,而死的细菌却无法计数因此,培养的理论依据已 有学者提出将宏 光原位杂交、基因芯片、宏基因组测序技法得出菌群失调的理论不够精确而分子生物基安与求进 术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究学技术方法的出现则为这些细菌的检测提供检测肠道菌群及 方面的应用,并对未来肠道菌群方面的研究了可能,他具有检测时间短、灵敏度高、结果其代谢产物来评 进行展望,希望为临床研究提供参考. 准确等优势,弥补了传统培养法的诸多不足,对人体的功效 被广泛地应用于肠道微生态生物研究时 The Author(s)2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved 2聚合酶链式反应技术 关键词:肠道菌群;检测方法;分子生物学技术聚合酶链式反应技术( polymerase chain reaction PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分 核心提示:分子生物学技术为菌群的研究提供子生物学技术,主要通过变性、退火、延伸三 了一个新视角,然而人类已经不仅仅满足于从个步骤完成参与复制的主要因素有DNA聚合 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化, 序技术使大规模菌群多样性研究成为可能 酶、连接酶、引物、核苷酸原料等 2.1针对16 S TRNA/DNA的PCR16 SIRNA基因 刘玉婷,郝微微,温红珠,邵兰君.肠道菌群的检测方法〗 是编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有 究进展世界华人消化杂志2016,2420:3142-3148URL:细菌的基因组中,具有高度保守性及变异性 http://www.wignet.com1009-3079uM24203142htm根据保守性设计出细菌通用引物,而可变区的 Dol:http:ldx.doi.org/10.11569/wcd.v24.120.3142 差异可以用来区分不同的细菌,一个16 SIrNA 的基因序列就代表着一种原核生物叫. Tiveljung 0引言 等使用16SDNA扩增技术,在克隆恩病患者 人的肠道中寄存着数量巨大、组成复杂的细菌病变肠组织中检测到李斯特菌和大肠埃希菌, 群,也是人体最庞大、最复杂的微生物群落,包从而推测出菌群紊乱与发病有关但是该方法 括大约30属1000多种细菌一般情况下,肠道存在一定的局限性 菌群与人体及外部环境保持着一个平衡状态,2.2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR(real 对人体的健康起着保护作用.然而,一旦菌群在 time quantitative poly merase chain reaction 数量、种属、比例等方面失调,这种平衡被打 qRT-PCR)反应中,引入荧光化学物质,随着 破,就可引起疾病.比如有研究发现溃疡性PCR反应的进行,产物不断累积,荧光信号也 结肠炎患者粪便中双歧杆菌的数量明显减少,不断增强,这时对荧光信号进行检测,通过标 肠球菌增加肝硬化患者肠杆菌科细菌明显增准曲线对未知模板进行分析,从而实现对起始 多,双歧杆菌和乳酸杆菌减少同时,许多疾模板的定量和定性分析.因此,与常规PCR相 病也可以引起菌群的失调,从而加重病情肠道比,实时荧光定量分析具有特异性强、灵敏 细菌的分析是一种非常复杂的工作,随着检测度高、重复性好、自动化程度高的特点,与 技术的进展,对肠道细菌的认识也在不断推进DGGE等传统分子技术相比,该技术可定量到 以下就几种常用的检测方法作简要分析 种的水平,具有其独特的优势叫 国内已有学者建立了较为系统的包括硬 1细菌培养 壁菌门菌等在内的9种肠道菌群及总量的荧光 传统培养法是微生物鉴定的基本方法,但存在定量PCR检测体系,不仅可以检测肠道各菌群 耗时长、培养要求高、影响因素多等问题.更的组成及特征,还可以定量分析,动态监测肠 重要的是,因为有些微生物要求的生长条件苛道菌群的数量变化,相对于之前的检测方法更 刻,有些是绝对的严格厌氧菌,还有些是在自加系统和全面L等采用实时荧光定量 然环境中与其他微生物形成共生关系,实验室PCR研究急性重症胰腺炎大鼠肠道菌群的变 3143 2016-07-18 Volume 24 I Issue 20 I刘玉婷, 等. 肠道菌群的检测方法及研究进展 WCJD|www.wjgnet.com 3143 2016-07-18|Volume 24|Issue 20| ■研发前沿 宏基因组测序为 后续研究肠道微 生 物 与 人 的 肥 胖、肠炎等疾病 的关系提供重要 的理论依据. 已 有学者提出将宏 基因组学与代谢 组学结合, 通过 检测肠道菌群及 其代谢产物来评 价药物、食物等 对人体的功效. 收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方 面发挥着重要作用, 与很多疾病的发生发展 相关. 研究肠道菌群对临床治疗具有非常重 要的意义. 本综述着重论述聚合酶链式反应 技术(polymerase chain reaction, PCR)、基于 PCR基础上的16S rDNA指纹图谱技术、荧 光原位杂交、基因芯片、宏基因组测序技 术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究 方面的应用, 并对未来肠道菌群方面的研究 进行展望, 希望为临床研究提供参考. © The Author(s) 2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved. 关键词: 肠道菌群; 检测方法; 分子生物学技术 核心提示: 分子生物学技术为菌群的研究提供 了一个新视角, 然而人类已经不仅仅满足于从 定性和定量的角度去分析肠道菌群的变化, 测 序技术使大规模菌群多样性研究成为可能. 刘玉婷, 郝微微, 温红珠, 邵兰君. 肠道菌群的检测方法及研 究进展. 世界华人消化杂志 2016; 24(20): 3142-3148 URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v24/i20/3142.htm DOI: http://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v24.i20.3142 0 引言 人的肠道中寄存着数量巨大、组成复杂的细菌 群, 也是人体最庞大、最复杂的微生物群落, 包 括大约30属1000多种细菌[1] . 一般情况下, 肠道 菌群与人体及外部环境保持着一个平衡状态, 对人体的健康起着保护作用. 然而, 一旦菌群在 数量、种属、比例等方面失调, 这种平衡被打 破, 就可引起疾病. 比如, 有研究[2-4] 发现溃疡性 结肠炎患者粪便中双歧杆菌的数量明显减少, 肠球菌增加. 肝硬化患者肠杆菌科细菌明显增 多, 双歧杆菌和乳酸杆菌减少[5,6] . 同时, 许多疾 病也可以引起菌群的失调, 从而加重病情. 肠道 细菌的分析是一种非常复杂的工作, 随着检测 技术的进展, 对肠道细菌的认识也在不断推进. 以下就几种常用的检测方法作简要分析. 1 细菌培养 传统培养法是微生物鉴定的基本方法, 但存在 耗时长、培养要求高、影响因素多等问题. 更 重要的是, 因为有些微生物要求的生长条件苛 刻, 有些是绝对的严格厌氧菌, 还有些是在自 然环境中与其他微生物形成共生关系, 实验室 很难模拟自然环境的条件, 因而无法得到其纯 培养物; 而且细菌培养涉及多种培养基的选择 和对微生物的检测, 这在很大程度上取决于技 术人员的经验和技巧[7] . 此外, 培养法只能培养 活的细菌, 而死的细菌却无法计数, 因此, 培养 法得出菌群失调的理论不够精确. 而分子生物 学技术方法的出现则为这些细菌的检测提供 了可能, 他具有检测时间短、灵敏度高、结果 准确等优势, 弥补了传统培养法的诸多不足, 被广泛地应用于肠道微生态生物研究[8] . 2 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)是一种用于放大扩增特定DNA片段的分 子生物学技术, 主要通过变性、退火、延伸三 个步骤完成. 参与复制的主要因素有DNA聚合 酶、连接酶、引物、核苷酸原料等. 2.1 针对16S rRNA/DNA的PCR 16SrRNA基因 是编码rRNA相对应的DNA序列, 存在于所有 细菌的基因组中, 具有高度保守性及变异性. 根据保守性设计出细菌通用引物, 而可变区的 差异可以用来区分不同的细菌, 一个16SrRNA 的基因序列就代表着一种原核生物[9] . Tiveljung 等[10] 使用16SrDNA扩增技术, 在克隆恩病患者 病变肠组织中检测到李斯特菌和大肠埃希菌, 从而推测出菌群紊乱与发病有关. 但是该方法 存在一定的局限性 2.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(real￾time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)反应中, 引入荧光化学物质, 随着 PCR反应的进行, 产物不断累积, 荧光信号也 不断增强, 这时对荧光信号进行检测, 通过标 准曲线对未知模板进行分析, 从而实现对起始 模板的定量和定性分析. 因此, 与常规PCR相 比, 实时荧光定量分析具有特异性强、灵敏 度高、重复性好、自动化程度高的特点, 与 DGGE等传统分子技术相比, 该技术可定量到 种的水平, 具有其独特的优势[11] . 国内已有学者建立了较为系统的包括硬 壁菌门菌等在内的9种肠道菌群及总量的荧光 定量PCR检测体系, 不仅可以检测肠道各菌群 的组成及特征, 还可以定量分析, 动态监测肠 道菌群的数量变化, 相对于之前的检测方法更 加系统和全面[12-14] . Li等[15] 采用实时荧光定量 PCR研究急性重症胰腺炎大鼠肠道菌群的变