所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每200个左右核苷酸才带有 个生物素残基,所以不会影响探针与靶核酸的杂交,足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern杂交中检测出单拷贝序列。相比之下,光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法,另外,光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多,所以,在进行探针标记时,人们首选的是酶学标记法 四、探针的纯化 般情况下,用于杂交的核酸探针在制备完成后,可直接用于进行杂交实验 但如果探针过长的话(>25nt),在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成,对于某些探针精度要求较高的实验,需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern杂交技术 Southern杂交的概念 Southern杂交技术是将凝胶电泳分离的酶切DNA片段通过印记法 ( Imprinting)转移到硝酸纤维素膜上,检测标记过的探针是否与变性后的DNA 发生杂交,而对靶DNA进行定性和定量的一项分子生物学技术,包括DNA的 印记转移和DNA的杂交两部分内容。 、 Southern杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组DNA,并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组DNA,消化后所得的DNA片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离,再对DNA进行原位变性,以印记法将DNA片段从胶上转移至固相支持物 上(如尼龙膜或硝酸纤维素膜)(图2-2-2),用标记的DNA或RNA探针在膜上 与转印后的DNA片段杂交,最后,针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶DNA 的存在及位置(图2-2-3)。 图2-2-2印记转移 图2-2-3 Southern杂交路线图所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每 200 个左右核苷酸才带有一 个生物素残基，所以不会影响探针与靶核酸的杂交，足以用于在针对哺乳动物基 因组中的 Southern 杂交中检测出单拷贝序列。相比之下，光化学标记法的标记 效率远低于酶学标记法，另外，光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号 强度要弱许多，所以，在进行探针标记时，人们首选的是酶学标记法。 四、探针的纯化 一般情况下，用于杂交的核酸探针在制备完成后，可直接用于进行杂交实验。 但如果探针过长的话（＞25nt），在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核 苷酸片段被合成，对于某些探针精度要求较高的实验，需要进行探针纯化。常用 的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。 第二节 Southern 杂交技术 一、Southern 杂交的概念 Southern 杂交 技术 是将 凝胶 电泳 分离 的酶 切 DNA 片段通 过印 记法 （imprinting）转移到硝酸纤维素膜上，检测标记过的探针是否与变性后的 DNA 发生杂交，而对靶 DNA 进行定性和定量的一项分子生物学技术，包括 DNA 的 印记转移和 DNA 的杂交两部分内容。 二、Southern 杂交的一般程序 首先从组织或培养细胞分离基因组 DNA，并以一种或多种限制性核酸内切 酶消化基因组 DNA，消化后所得的 DNA 片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分 离，再对 DNA 进行原位变性，以印记法将 DNA 片段从胶上转移至固相支持物 上（如尼龙膜或硝酸纤维素膜）（图 2-2-2），用标记的 DNA 或 RNA 探针在膜上 与转印后的 DNA 片段杂交，最后，针对不同的探针标记物选择特定的检测方法 如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶 DNA 的存在及位置（图 2-2-3）。 图 2-2-2 印记转移 图 2-2-3 Southern 杂交路线图